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Chapitre 3 : thermodynamique – deuxième et troisième principes

Deuxième principe :

Augmentation de l’entropie : l’entropie dans l’univers augmente au fil du temps.

entro1

L’entropie est une mesure du trouble d’un système. La deuxième loi de la thermodynamique a plusieurs formulations mais la plus commune est que le processus est si spontané, sans influence extérieure (système isolé), il induit une augmentation de l’entropie dans l’univers.

Par exemple si deux réservoirs sont reliés, l’un étant vide et l’autre plein de gaz, le gaz aura spontanément occupé l’ensemble du système même s’il ne comporte pas de variation de l’énergie.

entropie3

Le gaz se dilate car il y a plus de postes à occuper dans un plus grand volume. Une autre définition de l’entropie est un système qui tend à changer à l’état le plus probable.

Imaginez une petite boîte avec seulement quelques postes disponibles. Deux particules sont dans cette boîte et chacune occupe un seul endroit. Plusieurs combinaisons sont possibles :

entropie2

Si nous augmentons le volume de la boîte la quantité de possibilités augmente de façon exponentielle. Il est une entropie de la position/disposition. La formule de ce genre d’entropie pour une particule est :

entro2

Ω étant la quantité de configurations possibles pour cette particule.

Si le volume contenant cette particule passe d’un volume V1 à un volume V2, la variation de l’entropie est :

entro3

Le nombre de positions pour une particule est directement proportionnelle au volume et :

entro4

Pour les gaz dilués le volume des particules est négligeable en ce qui concerne le volume du système. En conséquence nous pouvons à peine ignorer la présence d’autres particules dans la formule et dire que pour les particules N(1 mole) :

entro5

Nous avons vu plus  tôt que dans la dilatation d’un gaz l’énergie était une fonction d’état mais que le travail et la chaleur ne l’étaient pas et donc la façon dont le processus se déroule a une influence sur le travail et sur la chaleur. La troisième voie que nous avons discutée a été le processus isotherme pour lequel nous avons trouvé une expression pour le travail :

Ce processus étant isotherme par conséquent :

ΔE=q+W=0.

Nous pouvons donc trouver la variation d’entropie pour ce processus à partir de la chaleur. Si le gaz se dilate la chaleur pénètre dans le système (il sera un processus endothermique).

La variation d’entropie est donc équivalente à la quantité de chaleur que le gaz doit absorber pour maintenir sa température constante.

Les états de la matière n’ont pas  la même entropie. Un gaz a une entropie supérieure à un liquide et celui-ci a une entropie plus grand que celle d’un solide. Nous pouvons facilement le comprendre par l’utilisation de la répartition des particules dans une petite boîte.

Dans un gaz (parfait) les particules n’ont pas d’interactions entre elles. Elles peuvent donc occuper une position quelconque du volume sans restriction. Dans un liquide les particules interagissent ensemble et restent groupées, mais la forme de leur assemblage n’ est pas fixe. Les possibilités sont donc plus limitées que pour un gaz. Dans un solide les particules sont complètement fixes dans une forme donnée. Les positions qu’un solide peut prendre sont donc plus limitées que celles qu’ un liquide peut prendre et de la même façon celles d’un liquide sont plus limitées que pour un gaz.

Il existe des tables d’entropies standards  sur lesquelles on peut trouver l’entropie des molécules dans un état donné à 298K.

Pour résumer plusieurs cas peuvent être distingués. Un processus se produit si la production d’entropie dans l’univers est positif. Cette production d’entropie est composée de la variation de l’entropie dans le système et dans l’environnement. L’un de ces composants de l’entropie peut être négatif si l’autre composant est positif et plus grand en valeur absolue.

Quand une réaction produit un gaz la variation de l’entropie est positive. Si cette réaction est exothermique la chaleur est transmise à l’environnement ce qui signifie que son entropie augmente. Cette réaction est donc spontanée. Si la réaction est endothermique la variation de l’entropie de l’environnement aurait été négative. La réaction peut encore être spontanée si la production d’entropie de la réaction est supérieure à la diminution de l’entropie dans l’environnement.

Cycle de Carnot :

Nicolas Léonard Sadi Carnot a proposé un moyen de convertir l’énergie thermique en travail. C’est un cycle thermodynamique, à savoir une série de transformations de l’Etat qui ramène à l’état initial, composé de deux processus isothermes (pas de variation de température) et deux processus adiabatiques (pas d’échange de chaleur avec l’environnement). Tous les processus sont réversibles et le cycle peut donc être fait dans le sens inverse : la conversion de travail en une différence de température.

L’installation est constituée d’un réservoir dont le volume peut varier et qui peut être en contact avec deux corps ayant une température de T1 et T2 respectivement, T1 étant supérieur à T2 .

carnot2

Première étape : l’expansion isotherme du gaz au T1. Le réservoir est en contact avec le corps chaud à T1. La chaleur q1 est échangée entre le corps et le réservoir de gaz qui se dilate sans variation de température. Il y a donc une variation de l’entropie :

ΔS1=q1/T1.

Deuxième étape : l’expansion adiabatique du gaz. Au cours de cette deuxième étape il n’y a pas d’échange de chaleur mais le volume du gaz continue à augmenter, faire du travail sur le piston et se refroidir du T1 au T2. Le corps à T = T1 n’est plus en contact avec le réservoir. Comme il n’y a pas d’échange de chaleur, il n’y a pas de variation de l’entropie.

Troisième étape : la compression isotherme du gaz au T2. Le réservoir est maintenant en contact avec le second corps à T = T2 ce qui provoque un transfert de chaleur q2 tandis qu’une compression est appliquée par le piston en maintenant la température constante. Il y a donc une variation de l’entropie :

ΔS2=q2/T2.

Quatrième étape : la compression adiabatique du gaz. Le corps à T = T2 n’est plus en contact et il n’y a pas de possibilité de transfert de chaleur. Le volume du gaz continue à diminuer  tandis que sa température  change  de T = T2 à T = T1. A la fin de cette étape le système est à nouveau dans les conditions (volume, température et pression) de l’état initial.

Le cycle peut être tracé dans le diagramme de phase pV comme indiqué ci-dessous :

carnot

L’efficacité de la R = W/q1 du cycle de Carnot serait de 100% si tout le travail W a été transformé en chaleur q. Le travail ici est la différence du chauffage q1-q2  parce AE = 0 = q + W (système isolé, les organismes à T1 et T2 étant dans le système). Par conséquent :

carnot4b

Il est possible de montrer que le rapport q2/q1 est égal au rapport T2/T1.

carnot3b

La conséquence est que l’efficacité n’est jamais de 100%, sauf au T2 = 0 K, que nous ne pouvons pas atteindre sur la terre. La perte d’énergie est provoquée par la production d’entropie.

L’ énergie libre de Gibbs :

Pour qu’une réaction se produise nous venons de voir que deux facteurs sont importants : l’enthalpie de réaction (si la réaction est exo ou endothermique) et la variation de l’entropie. L’énergie libre de Gibbs Ag regroupe les deux facteurs dans une équation :

gibbs2

Une réaction est spontanée si ΔG<0. La relation d’entropie et la température montrent clairement que la réaction peut être spontanée à une température donnée mais pas si la température est modifiée :

gibbs3

Nous pouvons trouver des tables pour  des valeurs standard de ΔH0 et ΔS0 et, par conséquent, de ΔG0 pour les réactions de formations de molécules. À différentes températures et  à 1 atm, la relation est :

gibbs4

Q est le coefficient réactif que nous avons déjà rencontré précédemment :

gibbs5

Par exemple, le coefficient réactif de cette réaction :

gibbs6

est

gibbs7

Si ΔG est négative, la réaction va vers la droite, si elle est positive, la réaction va vers la gauche. Si ΔG=0, nous sommes à l’équilibre. En conséquence nous pouvons trouver une relation reliant la constante d’équilibre K avec l’énergie libre de Gibbs :

gibbs8

Le potentiel chimique :

Le potentiel chimique μi est l’énergie d’une molécule i qui peut être utilisé au cours d’une réaction ou d’un procédé physique.

L’équation de Gibbs-Duheim :

gibbs9

Le dernier terme est donc une variation de l’énergie dans le système due à une variation de la quantité de particules dans le système, quelque chose que nous ne prenions pas en compte avant (il sera indiqué entre parenthèses dans les prochaines équations). La relation ci-dessus provient de la définition de G et de H :

Gibbs10

Les dérivées partielles de ces fonctions sont :

Gibbs11

Nous avons vu que l’énergie interne ∂U = ∂q + ∂W- (∑iNi∂μi) et que ∂S = ∂q / T et que ∂W = -p∂V. Par conséquent :

gibbs12

Le potentiel chimique est donc la variation de l’énergie libre de Gibbs à l’égard de la variation de concentration d’une espèce spécifique en maintenant les autres paramètres (p, T et les concentrations des autres espèces) constants :

gibbs13

Nous définissons également le volume molaire partiel :

gibbs14

C’est utile pour les gaz. De la loi des gaz parfaits :

gibbs20

Cela nous amène à l’expression du potentiel chimique d’un gaz :

gibbs15

En solution la formule est très semblable :

gibbs16

nous savons que :

gibbs17

Donc nous pouvons trouver l’expression de ΔG comme une fonction des pressions ou des concentrations des espèces :

gibbs18

Pourtant cela est seulement vrai pour des solutions et des gaz parfaits. Normalement nous devons considérer l’activité (a) de chaque molécule :

gibbs19

γ est égal à 1 pour les solutions idéales mais peut varier si la concentration augmente ce qui représente l’augmentation des interactions entre les espèces. Cependant l’activité a de solides est égale à 1.

Troisième principe :

L’entropie d’un cristal parfait au zéro absolu est exactement égale à zéro.

La troisième loi constitue une référence pour l’entropie d’un cristal pur (et donc à quoi que ce soit) à toute température. Un cristal parfait et pur est un cristal dont la disposition est parfaitement organisée : il n’y a pas de défaut, la matrice est régulière et il est composé par une espèce. Au zéro absolu, soit zéro Kelvin, l’état du système est au niveau le  moins possible d’énergie. Cet état est unique en raison de la mécanique quantique et  c’est effectivement le cas : il n’y a qu’une seule façon de placer les atomes dans un cristal parfait. La quantité de configurations possibles est donc une, ce qui conduit à une entropie égale à :

3thermo1

Si un état de base est dégénéré, à savoir qu’il y a plusieurs états de même énergie, il existe plusieurs différentes configurations possibles pour Ω et l’entropie n’est pas égale à 0 mais est très proche de lui. Dès qu’il y a un défaut dans le cristal la quantité de configurations possibles augmente et l’entropie aussi, conduisant à une certaine énergie que la seconde loi, nous  dit que :

3thermo2

L’élévation de température dT due à la chaleur ∂Q est déterminée par la capacité calorifique (cp ≈ CV) du cristal :

3thermo3

Les conséquences de la troisième loi :

Une première conséquence de la troisième loi est que T = 0 K ne peut être atteint par aucun nombre de processus finis. C’est dû au fait qu’il n’y a qu’un seul état d’énergie minimum. Si nous essayons de changer un paramètre donné d’une manière contrôlée, afin que l’énergie diminue à chaque fois, il faudrait un nombre infini de répétition pour atteindre le zéro absolu. Il est un peu similaire au problème de la balle : si, à chaque période de temps, une balle se déplace de la moitié de la distance nécessaire pour atteindre son objectif, la cible sera abordée, mais jamais atteinte. Si plusieurs états ont été autorisés à T = 0 K, il serait possible de passer le paramètre pour obtenir l’un ou l’autre état : une valeur du paramètre se rapproche du système d’un état et l’autre paramètre se rapproche du système de l’autre état. Avec un seul objectif, nous ne pouvons pas passer d’une valeur du paramètre à l’autre et atteindre l’état final. Nous pouvons visualiser cela comme ceci :

3thermo

Une deuxième conséquence est que la capacité de chaleur cp et cV  tendent vers zéro quand T tend vers zéro.

Chapitre 5 : cinétique chimique – vitesse de la réaction

Cinétique chimique :

La cinétique est un domaine de la chimie qui étudie la vitesse des réactions. La vitesse de la réaction peut dépendre des conditions de la réaction. Par exemple lorsque nous mettons H2 (g) et O2 (g) nous ne produisons pas de l’eau spontanément :

kine30

Cette réaction a une ΔG0 très négative. Cependant si nous produisons une étincelle la réaction va aller très vite.

Nous avons vu que la température a une influence sur l’équilibre des réactions. Au SCTP la formation d’ammoniac a une ΔG0 négative mais  devient positive pour des températures de plus de 434 K :

kine31

Sans variation de température une réaction peut être accélérée si l’on utilise un catalyseur. Nous allons discuter des catalyseurs plus loin dans ce chapitre.

Il peut donc être important de connaître la vitesse des réactions en fonction de différents paramètres afin d’optimiser la production d’une molécule particulière, la destruction de certains déchets ou tout autre procédé.

La vitesse d’une réaction est une variation de la concentration des espèces engagées dans la réaction en fonction du temps. Elle est toujours positive. Comme il peut y avoir plusieurs différents coefficients stoechiométriques, nous devons nous entendre sur la définition de la vitesse d’une réaction parce que les concentrations ne varient pas de la même façon. Pour obtenir cette vitesse, on divise la variation dans le temps de la concentration des espèces correspondantes  par le coefficient stoechiométrique. Dans la réaction :

kine32

nous considérons une seule vitesse de réaction qui est :

kine33

Les concentrations des réactifs diminuent au fil du temps et le débit est de signe opposé à la variation de leur concentration :

kine29

Pendant la réaction la vitesse dépend de la concentration de toutes les espèces impliquées :

kine34

Les coefficients α, β et γ sont  l’ordre de la réaction en ce qui concerne les espèces correspondantes et leur somme α + β + γ est  l’ordre global de la réaction. L’ordre de la réaction à l’égard de l’une des espèces est souvent leur coefficient stoechiométrique mais pas systématiquement.

A l’équilibre la vitesse de la réaction dans une direction est égale à la vitesse de la réaction dans l’autre sens :

kine35

Il est faux de dire que v = 0. Les deux réactions ont la même vitesse.

Au début de la réaction on peut négliger les concentrations des produits de l’expression de la vitesse avec β = γ = 0. La vitesse au début de la réaction est donc simplement :

 kine36

Méthode intégrale :

On peut déterminer l’ordre de la réaction en ce qui concerne une espèce en gardant constante la concentration des autres réactifs. Fondamentalement nous mettons un grand excès de réactifs sauf pour les espèces que nous voulons étudier. De cette façon, seulement, une concentration varie de façon significative. Pendant la réaction on détecte la variation de la concentration de l’espèce cible dans le temps :

kine37

Nous nous concentrons sur la période de temps juste après le début de la réaction. Avant cela  il n’y a aucune variation  détectable (le réactif n’est probablement même pas dans la solution), puis les produits peuvent jouer un rôle dans la vitesse de réaction.

Si la réaction a un ordre égal à 1 à l’égard des espèces cibles la vitesse est :

kine39

Et ainsi nous pouvons trouver une ligne droite lorsque nous traçons ln [A] en fonction du temps dont la pente est -ak :

kine38

Si l’ordre = 2, le ln [A] ne donnera pas une ligne droite mais 1/[A] le fera. Dans ce cas la pente est ak :

kine40

L’ordre peut également être égal à zéro ce qui signifie que la concentration du réactif n’a pas d’importance (sauf pour de très faibles concentrations). Cela signifie que la réaction est limitée par quelque chose d’autre. Nous observons souvent un ordre zéro avec les réactions qui se déroulent en présence d’un catalyseur.

Les catalyseurs sont des espèces qui affectent la réaction mais ne sont pas consommés pendant la réaction. Les catalyseurs les plus communs sont solides mais certains catalyseurs sont liquides. Sur les catalyseurs solides les réactifs peuvent se lier. En raison de cette nouvelle liaison, les liaisons dans le réactif sont plus faibles et la réactivité est améliorée. La réaction est ainsi limitée par l’espace disponible sur le catalyseur. La solution est mélangée au cours de la réaction afin qu’il y ait toujours des réactifs au voisinage du catalyseur. Sinon les réactifs seront de plus en plus loin du catalyseur au fur et à mesure que le temps passe. L’évolution de la concentration serait plus complexe dans ce cas. Nous allons discuter à propos des catalyseurs plus tard.

La méthode des vitesses initiales :

Au lieu d’utiliser des excès de réactifs nous pouvons faire plusieurs expériences et varier la concentration, à chaque fois :

kine42

n’est évidemment pas une réaction simple. La vitesse dépend simultanément des trois réactifs BrO3, Br et H+. Nous faisons d’abord la réaction avec des concentrations identiques [BrO3] = [Br] = [ H+] = 0.1M. Nous analysons l’évolution de la concentration d’une espèce en fonction du temps et on ne considère que la variation de concentration directement après le début de la réaction pour déterminer la vitesse de la réaction :

kine41

Dans un second temps nous faisons la même réaction mais modifions la concentration d’un des réactifs. La vitesse de réaction va changer en conséquence et ainsi nous pouvons déterminer l’ordre pour chaque espèce. Finalement lorsque nous savons tous les ordres nous pouvons déterminer la valeur de k.

Modèle de collisions :

Les réactions sont décomposées dans les événements élémentaires. Dans ce cas l’ordre est le coefficient stoechiométrique (généralement 1 ou 2). Les événements élémentaires sont des réactions qui sont effectuées en une seule étape : tout est fait lors de la collision entre les deux molécules :

kine50

Par exemple la réaction entre le monoxyde de carbone CO et le NO2 est un événement primaire : l’atome d’oxygène est transféré de NO2 au CO lors d’une collision entre les deux espèces. Lorsque l’impact se produit et les molécules sont dans la bonne orientation la liaison N-O s’affaiblit et simultanément une liaison est formée entre C et O :

kine51

Les collisions entre les molécules ne conduisent pas toujours à un nouveau produit et il y a des conditions pour que la réaction se produise. Le produit intermédiaire de réaction OCONO ne peut être obtenu que si la collision vient d’un angle donné : l’intermédiaire est linéaire. En plus de cette limitation spatiale pour transférer l’atome d’oxygène la liaison entre O et N doit être étirée, ce qui nécessite de l’énergie. Enfin il existe une variation du nombre de moles de gaz au cours de cette réaction : NO est un liquide et par conséquent il implique une diminution de l’entropie qui doit être entièrement dégagée.

Il existe donc un minimum d’énergie qui est nécessaire pour obtenir la réaction. Cette énergie est appelée l’énergie d’activation. On peut représenter l’évolution d’une réaction par le graphique suivant :

kine49

Les réactifs, pris séparément, ont une quantité donnée d’énergie. Les produits de la réaction ont une énergie plus faible. La différence d’énergie entre les produits et les réactifs est l’enthalpie de la réaction. Pour obtenir les produits l’énergie d’activation est similaire à une barrière qui doit être montée. Au sommet de cette barrière se trouve l’état excité, appelé de cette façon parce qu’il est riche en énergie. Après l’état excité l’énergie diminue vers le bas pour atteindre le niveau d’énergie, des produits, qui doit être inférieur à l’énergie des réactifs.

Pour faire la réaction dans l’autre direction, en formant du CO et NO2, l’énergie d’activation est beaucoup plus grande et les produits sont énergétiquement moins favorables. La différence entre les deux énergies d’activation est aussi égale à l’enthalpie de réaction.

Pour dépasser l’énergie d’activation les molécules doivent avoir assez d’énergie cinétique. Si tel est le cas elles auront des collisions avec succès. Rappelez-vous que l’énergie cinétique des molécules dépend de la température. Si la température augmente une plus grande population de molécules aura une énergie cinétique supérieure à l’énergie d’activation.

Dans l’expression de la vitesse de la réaction on trouve ces dépendances dans la constante de vitesse k :

kine53

Le paramètre d’énergie se trouve dans l’exponentielle et le paramètre spatial et la fréquence, des collisions, se trouvent dans la constante A.

Notez que les molécules lentes peuvent également réagir si elles ont une grande énergie potentielle par exemple beaucoup d’énergie de vibration. Au lieu de l’énergie cinétique l’énergie potentielle est utilisée :

kine54

Par conséquent si deux NOBr sont correctement alignés ils peuvent former Br2 même si leur énergie cinétique est faible en raison de la vibration des liaisons Br-N :

kine52

Eventuellement les liaisons N-Br peuvent être étirées simultanément, en approchant les deux Br l’une de l’autre on peut faciliter la formation de Br2.

La vitesse de la réaction pour former l’acide iodhydrique à partir d’hydrogène et d’iode peut nous faire penser que c’est une réaction élémentaire :

kine56

En effet les exposants des concentrations sont les coefficients stoechiométriques des réactifs. Toutefois cette réaction n’est pas une réaction élémentaire. Pour être une réaction élémentaire il faudrait que les molécules soient alignées d’une manière spécifique et que les liaisons se cassent et se forment en même temps. Cela signifie que les quatre événements doivent se produire en même temps, en plus de l’angle de collision spécifique :

kine55

Pourtant la réaction se fait à une vitesse telle que nous pouvons penser à un événement élémentaire. Alors que la réaction complète est la succession de plusieurs évènements élémentaires qui se produisent l’un après l’autre.

La première étape est la dissociation homolytique de I2. Cela se fait à l’aide d’un métal  catalyseur :

kine57

Il a été observé que la composition du récipient peut affecter la vitesse de la réaction. La dissociation se fait donc à la surface du récipient. Après la dissociation I peux réagir avec H2 pour former H2I qui peut réagir avec le second I de la première réaction pour produire 2 HI.

kine58

Alors que la dernière réaction est complète, la première et deuxième réaction sont des réactions d’équilibre et peuvent donc aller dans les deux sens.

La vitesse globale de la réaction est déterminé par l’événement primaire le plus lent. Cette étape lente est la dernière réaction :

kine59

Comment nous pouvons prouver que cette vitesse est égale à celle obtenue expérimentalement?

kine60

Pour obtenir une telle chose, nous utilisons deux hypothèses :

les réactions d’équilibre sont presque à l’équilibre : la troisième réaction est plus lente que les deux premières réactions et on suppose que la différence de vitesse est telle que les premières réactions (presque) ont le temps pour atteindre l’équilibre. Par conséquent, on peut dire que pour ces deux réactions la vitesse dans une direction est égale à la vitesse dans la direction opposé :

kine61

Le rapport entre les constantes de réaction k1 / k-1 est la constante K1 global.

kine62

Nous pouvons faire la même chose pour la deuxième équation :

kine63

Nous pouvons maintenant remplacer les concentrations de v3 avec les expressions que nous avons trouvées tout à l’heure :

kine64

La constante qui a été trouvée expérimentalement est donc une combinaison des trois constantes de réaction.

la concentration de H2I est constante :

kine65

H2I est le produit de la deuxième réaction et le réactif de la troisième réaction. Par cette hypothèse nous supposons que dès que H2I est produit, il sera consommé par l’étape suivante de la réaction ou redevient H2 et I par l’inverse de la deuxième réaction.

kine66

Nous pouvons insérer cela dans l’expression de la v3 :

kine67

Étant donné que  v1=v-1  (à partir de la première hypothèse), [I]2=K1[I2]  et :

kine68

Nous avons ici la même expression que celle que nous avons obtenue avec la première hypothèse dans le numérateur. Nous pouvons donc faire l’hypothèse que la concentration de H2I est constante si K3 [I] / k-2 << 1, à savoir que la concentration de I est petite et que k3<<k-2. Elle est donc seulement correcte au début de la réaction.

Nous pourrions penser que l’hydrogénation de Br2 suit la même cinétique, mais nous sommes loin de la vérité. En effet :

kine69

Cette réaction est également une série d’étapes élémentaires

kine70

 Le catalyseur :

Un catalyseur est une espèce qui est impliquée dans une réaction mais non consommée ou produite pendant la réaction. Il permet à la réaction de se produire par une diminution de l’énergie d’activation.

 

kine75

Un catalyseur peut être dans la même phase que les réactifs, dans ce cas on parle d’un catalyseur homogène ou dans une phase différente, comme par la réaction entre H2 et I2  dans lequel le catalyseur est la surface du récipient, un solide. Dans ce cas nous parlons d’un catalyseur hétérogène. Il existe au moins 4 étapes de l’action du catalyseur. Nous allons les voir dans la réaction de l’hydrogénation catalytique de l’éthylène :

Adsorption et activation des réactif s: les espèces qui se trouvent dans le voisinage du catalyseur hétérogène peuvent se lier à lui. En terme d’entropie la liaison est assez neutre : les espèces proviennent d’un liquide à lier sur une surface où beaucoup de places sont possibles. Il existe donc un grand nombre de configurations possibles sur la surface.

kine71

Migration des réactifs sur la surface : les réactifs doivent être à proximité les uns des autres  pour réagir ensemble

kine72

Réactions

kine73

La désorption des produits 

kine74

Dans le cas d’un catalyseur homogène le catalyseur est juste une espèce qui intervient au cours de la réaction mais non consommé par elle. Dans des niveaux élevés de l’atmosphère, le NO agit comme un catalyseur dans la destruction de l’ozone.

Le cas de la couche d’ozone :

La formule de l’ozone est O3. Cette molécule est sensible aux rayons UV qui la divise en O2 et un radical O.. Un radical est une espèce ou une molécule qui a des électrons de valence non appariés et qui est très réactif. Il est généralement le résultat d’une dissociation homolytique, à savoir les électrons de la liaison sont partagés de manière égale entre les deux atomes. Il est si réactif qu’il peut briser des molécules voisines pour former une liaison. Nous utilisons des radicaux pour produire des polymères (qui seront vus dans le chapitre correspondant) et aussi dans les produits antibactériens. Le bon point de l’utilisation de l’ozone comme un produit antibactérien est qu’il rejette l’oxygène O2 en tant que déchet, de sorte qu’il est propre pour l’environnement.

La destruction de l’ozone se fait en deux étapes : la première étape est la dissociation d’un radical Osous le rayonnant de photons UV.

kine76

Le radical peut réagir avec l’O2 (réaction inverse) pour revenir à l’ozone ou de réagir avec une autre molécule d’ozone pour former plus d’O2.

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Au total on obtient 3 O2 à partir de 2 molécules O3.

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Le radical O. n’est pas un catalyseur de la réaction même si nous ne trouvons pas dans la réaction globale car elle est produite et consommée pendant la réaction. C’est une espèce qui est déjà présente dans le système dès le début et qui reste dans le système une fois que la réaction est terminée. La vitesse que nous trouvons expérimentalement est :

kine79

Ce n’est pas la vitesse que nous pourrions nous attendre d’une réaction en une seule étape. Nous pouvons faire l’analyse cinétique de la réaction. L’étape de détermination de cette réaction est la deuxième réaction.

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La concentration du radical est difficile à déterminer mais nous pouvons encore faire les mêmes hypothèses que nous avons faites avec la réaction entre H2 et I: la concentration du produit intermédiaire ne change pas et la première réaction est à l’équilibre :

kine81

On peut insérer cela dans l’expression de la vitesse :

kine82

Chapitre 11 : Réactions de substitution sur les cycles aromatiques

Les cycles aromatiques, tels que le benzène, sont très stables en raison de leur énergie de résonance. Par conséquent, il est très difficile d’ « ouvrir » le cycle habituel par une réaction d’addition.

aro1

Au lieu de réactions d’addition, on observe des réactions de substitution. Le mécanisme comporte deux étapes.

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1) la première étape est l’attaque électrophile d’une liaison π sur un électrophile. Comme cette étape implique la perte d’aromaticité du substrat, cette étape est lente et l’étape de détermination de la réaction. Le produit de cette étape est appelé un intermédiaire de Wheland ou un ion arénium.
2) la deuxième étape comprend l’enlèvement d’un proton du cycle pour régénérer l’aromaticité. Cette étape est rapide.
La plupart des électrophiles doivent être activés pour permettre à la première étape de la réaction de se faire. Elle se fait par un acide de Lewis

Halogénation :

FeBr3 et AlCl3  peuvent être utilisés comme acides de Lewis pour lier un atome d’halogène (Br et Cl respectivement) sur un noyau benzénique.

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Ils améliorent le caractère électrophile de l’halogène qui peut désormais être attaqué par le substrat aromatique.

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FeBr4 agit comme une base pour prendre un proton et fermer l’anneau.

Dans le tableau suivant nous pouvons trouver des énergies de liaison impliquées dans le processus pour les halogènes. Sur la gauche nous avons les énergies pour les réactifs et dans la colonne du milieu nous avons les énergies pour les produits. L’enthalpie de réaction est représentée sur la colonne de droite.

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Si nous jetons un coup d’oeil à la variation de l’énergie impliquée par une halogénation, nous voyons que l’enthalpie de réaction est positive pour l’iode. La réaction n’est donc pas faite. La réaction est très exothermique pour F2. En fait cette réaction est explosive, Pour Cl et Br, nous avons besoin d’utiliser des catalyseurs (les acides de Lewis).

La sulfonation et la nitration :

SO3 et NO2+ sont suffisamment électrophiles pour se lier à un cycle aromatique.

La nitration :
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Le nitrate peut être réduit de façon sélective pour obtenir une amine

Sulfonation :

L’atome de soufre est électrophile en raison du caractère  électrocapteur des oxygènes. Cependant la réaction est réversible en présence d’eau pour former de l’acide sulfurique. Ce processus est exothermique et on devrait garder un oeil sur lui.

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Nous produisons des détergents à partir de l’acide benzènesulfonique.

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Et à partir de ce point, nous pouvons produire des sulfamides qui sont généralement de bons antibiotiques.

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La première de ce genre était le Prontosil (4 – [(2,4-diaminophényl) azo] benzènesulfonamide) en 1932, développé par Domagk chez Bayer, qui a remporté un prix Nobel de médecine pour elle en 1939. Le programme de recherche a été conçu pour rechercher des agents qui pourraient agir comme médicaments antibactériens dans le corps. La découverte et le développement de ce premier sulfamide ont ouvert une nouvelle ère en médecine. Voici d’autres exemples d’agents antibactériens :

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Alkylation de Friedel-Crafts :

Cette réaction, comme son nom l’indique, permet de lier une chaîne sur un cycle aromatique. La chaîne qui doit être ajoutée doit avoir un carbone électrophile. Encore une fois nous avons besoin d’un acide de Lewis pour faire cette réaction. La première étape est l’activation de l’halogénoalcane par l’acide de Lewis.

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Ensuite le cycle attaque l’alcane, éjectant l’acide de Lewis halogène. Le produit de cette étape est appelé un intermédiaire de Wheland ou un ion arénium. Cette étape est l’étape de détermination de la réaction impliquant l’ouverture de la bague en raison de l’attaque électrophile. Un proton est prise par l’acide de Lewis halogéné pour donner l’aromaticité avant avec la récupération de l’acide de Lewis et la libération d’un acide. Cette étape est rapide par rapport à l’étape précédente. Comme résultat global nous avons ajouté une nouvelle chaîne de carbone sur le noyau phényle.

L’halogène sur la chaîne ajoutée n’est pas obligatoire. Un alcool ou d’autres précurseurs de carbocations peuvent aussi faire le travail.

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L’alkylation peut être intramoléculaire si elle aboutit à un nouveau cycle.

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Les limitations de la méthode :

Le groupe alkyle qui a été ajouté au groupe phényle est un groupe donneur inductif. Cela signifie qu’il donne une partie de sa charge au phényle en augmentant sa capacité à attaquer les carbones électrophiles. En conséquence le processus d’alkylation ne cesse pas après l’ajout d’une chaîne si il y a encore de la place sur le phényle pour accueillir de nouvelles chaînes (nous verrons un peu plus tard sur quelle position, quel groupe peut être ajouté).

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Une seconde limitation est le réarrangement du carbocation (comme d’habitude).

Acylation de Friedel-Crafts

La différence entre l’alkylation et l’acylation est que, pour ce dernier l’électrophile est un cation d’ acylium, conduisant à l’addition de -C = O-R sur le noyau phényle.

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L’ion acylium est obtenu à l’aide d’un acide de Lewis

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Le reste du processus est identique.

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Cependant, il n’y a pas de polyacylation parce que le groupe carbonyle est un capteur inductif et mésomère en prenant des électrons du cycle. Il est possible de réduire la cétone avec la réaction de Clemmensen ou de Wolff-Kishner.

La régiosélectivité :

Un benzène qui porte déjà un groupe peut être attaqué sur 3 positions non équivalentes : ortho, méta et para. Certains groupes peuvent orienter la réaction vers les positions ortho ou para et d’autres groupes vers la position meta.

Effet mésomère :

L’effet mésomère est la possibilité pour un hétéroatome de partager une paire solitaire avec des atomes voisins. Par exemple O et N sont des donateurs mésomères. Ils peuvent stabiliser les carbocations par le partage d’un de leurs paires seules qui contrebalancent la charge positive. Ils améliorent également le caractère nucléophile des liaisons doubles. Nous notons les donateurs mésomères par  +M.

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Les groupes peuvent également être accepteurs mésomères et sont notés -M. Par exemple, le groupe NO2 est un accepteur mésomère parce qu’il a une forme de résonance qui peut garder la charge supplémentaire.

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Notez que l’oxygène peut être mésomère donneur ou accepteur en fonction du groupe dans lequel il est et la structure de la molécule.

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Effet inductif :

Lorsque deux atomes ont une électronégativité différente, il y a un déplacement d’électrons de l’atome moins électronégatif vers l’atome plus électronégatif. Les groupes ou atomes peuvent donc prendre ou donner des électrons depuis ou vers les atomes voisins. Les atomes ou groupes qui prennent les électrons du reste de la molécule sont des accepteurs  inductifs et sont notées -I. Ils déstabilisent les carbocations et les charges positives et peuvent augmenter le caractère électrophile de l’atome avec lequel ils sont liés. Par exemple, le carbone d’un carbonyle donne une partie de sa charge à l’oxygène et porte une accusation partielle positif δ+. Un nucléophile est donc enclin à attaquer ce carbone.

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Les atomes qui sont moins électronégatifs que le carbone vont donner une partie de leur charge à la chaîne. Ceux-ci sont appelés les donneurs inductifs et sont notés +I. Le plus simple donneur inductif est H qui est moins électronégatif que le carbone. Cependant H est pris par convention comme l’intensité neutre de l’effet inductif. -CH3 est un donneur inductif parce que l’effet inductif de  3 hydrogènes est transmis à travers la chaîne carbonique (plus de 2-3 carbones). En conséquence les groupes alkyle sont des donneurs inductifs. L’effet est plus fort pour un groupe -C (CH3) 3 que pour -CH3 car le nombre d’atomes d’hydrogène qui peuvent partager leurs électrons est plus élevé.

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L’hybridation du carbone est une chose à prendre en compte pour déterminer l’effet inductif. Les électrons dans les orbitales « s » sont plus liés à l’atome que celles des orbitales p. En conséquence l’électronégativité des atomes de carbone sp2 est légèrement supérieure à l’électronégativité des atomes de carbone  sp3.

Régiosélectivité en fonction des substituants des cycles aromatiques

Les effets mésomères et inductifs sont cumulatifs et un atome d’azote dans un groupe NH2 est simultanément un donneur mésomère et l’accepteur inductif (+IM). L’effet mésomère prévaut toujours en intensité.

Les donneurs inductifs :

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Les groupes qui sont des donneurs d’électrons par hyperconjugaison (ou les donneurs inductifs) activent ou favorisent l’ajout de nouveaux groupes sur le carbone. La substitution est orientée vers les positions ortho et para parce que le carbocation qui en a été fait au cours de la première étape de la substitution peut être stabilisée par le donneur inductif.

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Il est impossible de placer la charge positive à l’endroit du groupe si la substitution devait être faite sur la position méta. Habituellement la position para est favorisée par rapport à la position ortho en raison de l’encombrement stérique. Cependant certains groupes, tels que NO2, semblent montrer plus d’intérêt à la position ortho.

Les capteurs inductifs :
les électrocapteurs inductifs orientent la réaction  dans la position méta. La raison est que dans les deux autres positions le carbocation peut être aux pieds du groupe CF3 qui veut prendre plus d’électrons, déstabilisant encore plus le carbocation.

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Les donneurs mésomères :
les électrodoneurs mésomères activent et orientent la réaction en ortho/para parce qu’il y a une forme de résonance supplémentaire.

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Notez que NH2, ainsi que l’oxygène de l’éther, est un donneur mésomère et un capteur inductif. L’effet mésomère est toujours plus important que l’effet inducteur.

Les capteurs mésomères :
Les groupes qui sont électrocapteurs par résonance orientent la réaction dans la position méta.

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Les halogènes :
les halogènes sont désactivants mais orientent la réaction en ortho et para.

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L’encombrement stérique ici est très important et explique la différence de population entre les réactions ortho et para.

S’il y avait deux groupes sur le cycle phényle les effets sont additifs et la substitution est faite sur les positions les plus activées/moins désactivées.

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Les deux groupes méthyle du xylène (diméthylbenzène) indiqués ci-dessous sont activants et orientent dans ortho/para. Comme les deux sont des groupes d’activation ce réactif est plus réactif que le toluène. Les positions 2, 4 et 6 sont ainsi favorisées. Les positions 4 et 6 sont légèrement plus probables car il y a  moins d’encombrement stérique. Dans le cas du xylène les fentes sont à peu près équivalentes.

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Dans le cas des groupes de désactivation la même réflexion est faite. Le COOH oriente en position méta et la position 5 est la position la moins désactivée.

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La substitution nucléophile :

La substitution nucléophile sur des noyaux aromatiques est plus lente que la substitution électrophile et  les substitutions sur des carbones sp3.

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La raison en est que le cycle est déjà plein d’électrons. En outre un carbone sp2 est plus électronégatif que le carbone sp3. Il est donc difficile d’ajouter un nucléophile (qui aime les charges positives) sur un groupe phényle et la présence d’un groupe de capteur sur le phényle est nécessaire pour stabiliser le carbanion. Le groupe partant doit être un bon.

Plusieurs mécanismes sont possibles pour ajouter un nucléophile sur un substrat aromatique. L’un d’eux est l’addition-élimination.

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Le groupe d’activation (ici NO2) est nécessaire pour stabiliser la charge négative du carbanion formé lors de la première étape de la réaction qui est la plus lente. Le complexe intermédiaire est appelé complexe intermédiaire de Meisenheimer.

La séquence de réactivité halogène (comme groupe partant) est opposée à celle de SN2. Sur une chaîne aliphatique le clivage de la liaison C-X est faite au cours de l’étape déterminant de la SN2. Sur un cycle aromatique le clivage ne se produit pas au cours de l’étape déterminante. En outre les halogènes prennent des électrons du cycle et les petits halogènes sont donc plus réactifs que les grands. En conséquence nous avons les séquences de réactivité suivantes :

Aliphatique : F<<Cl<Br<I

Aromatique : F>>Cl>Br>I

Un atome hétérogène dans le cycle (O ou N) peut jouer le rôle du groupe de capteur.

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Une application de ce mécanisme est la détermination de l’acide aminé terminal des peptides. Le peptide réagit avec un composé aromatique par l’intermédiaire de son groupe amine terminal.

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Une fois que les deux substrats sont liés ensemble nous hydrolysons les liaisons peptidiques (cf les amides). Tous les acides aminés sont maintenant séparés mais seulement l’un d’eux est lié au groupe aromatique.

Le mécanisme SN1 

Ce mécanisme est surtout utilisé pour produire des sels d’arènediazonium. Cette espèce est obtenue à partir de l’aniline C6H7N avec NaNO2 dans un environnement acide.

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Le mécanisme est le suivant :

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Les sels d’arènediazonium sont stables à basse température et perdent N2 à des températures plus élevées, ce qui libère un cation phényle qui peut réagir avec un nucléophile.

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Les halogènes autres que l’iode ne donnent pas de bons résultats en raison de réactions secondaires. Pour ajouter Cl, Br ou F sur un cycle aromatique, on utilise la réaction de Sandmeyer en utilisant des sels de cuivre tels que CuCl, CuBr ou CuCN. Le mécanisme est un peu plus complexe et fait intervenir des radicaux.

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Le mécanisme comportant un benzyne :

Normalement les halogenoarenes ne peuvent pas faire des réactions SN2  ou SN1. Toutefois, dans des conditions très dures de température et de pH, il est possible de forcer pour faire de telles réactions.

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Le mécanisme implique une triple liaison dans le cycle, les espèces étant appelée benzyne, l’existence de cet intermédiaire a été montrée par un marquage isotopique. Le C lié à l’halogène est un isotope et nous observons un mélange racémique en tant que produit:

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Chapitre 1 : La réplication de l’ADN

Bien avant que la structure de l’ADN ne soit connue, les scientifiques se sont interrogés sur la capacité des organismes à créer des copies fidèles d’eux mêmes et, plus tard, sur la capacité des cellules à produire plusieurs copies identiques de macromolécules complexes. La spéculation à propos de ces problèmes était centrée sur le concept d’un « modèle », une structure qui permettrait aux molécules d’être alignées dans un ordre spécifique et jointes, pour créer une macromolécule avec une séquence et une fonction uniques. Les années 1940 ont apporté la révélation que l’ADN était ce modèle (la molécule génétique), mais ce n’est que lorsque Watson et Crick ont décrit sa structure, que la façon dont l’ADN pourrait servir de modèle pour la réplication et la transmission de l’information génétique est devenue claire.: chaque brin est le complément de l’autre. Les règles d’appariement de bases strictes signifient que chaque brin fournit le modèle pour un brin frère avec une séquence prévisible et complémentaire

DNA structure

Les nucléotides (les éléments constitutifs des acides nucléiques) et les propriétés fondamentales du processus de réplication de l’ADN et les mécanismes utilisés par les enzymes qui le catalysent se sont révélés essentiellement identiques chez toutes les espèces. La recherche précoce sur la réplication de l’ADN bactérienne et ses Enzymes ont permis d’établir les propriétés fondamentales qui sont applicables à la réplication de l’ADN chez tous les organismes.

La réplication de l’ADN est semiconservative Chaque brin d’ADN sert de modèle pour la synthèse d’un nouveau brin, produisant deux nouvelles molécules d’ADN, chacune avec un nouveau brin et un ancien brin. C’est une réplication semi-conservative. Watson et Crick ont proposé l’hypothèse d’une réplication semi-conservatrice peu après la publication de leur article de 1953 sur la structure de l’ADN, et leur l’hypothèse a été prouvé par des expériences conçues par Matthew Meselson et Franklin Stahl en 1957.

semi conservative

Meselson et Stahl ont cultivé des cellules d’E. coli pendant de nombreuses générations dans un milieu où la seule source d’azote (NH4Cl) contenait 15N, l’isotope «lourd» de l’azote. , au lieu de l’isotope « léger » normal de 14N, plus abondant dans la nature. L’ADN isolé à partir de ces cellules avait une densité supérieure d’environ 1% à celle de l’ADN [14N] normal (figure 25-2a). Bien que ce soit seulement une petite différence, un mélange d’ADN lourd [15N] et d’ADN léger [14N] peut être séparé par centrifugation jusqu’à l’équilibre dans un  gradient de densité de  chlçorure de césium. Les cellules d’ E. coli cultivées dans le milieu 15N étaient transférés dans un milieu frais contenant uniquement l’isotope 14N, où ils ont été laissés pousser jusqu’à ce que la population cellulaire ait juste doublé. L’ADN isolé de ces cellules de première génération ont formé une seule bande dans le gradient de densité de CsCl gradient à une position indiquant que le double helice des molécules d’ADN des cellules filles étaient des hybrides contenant un nouveau brin 14N et un parent 15N.

meselson

Ce résultat plaide contre la réplication conservatrice, une hypothèse alternative dans laquelle la molécule d’ADN fille consisterait en deux brins d’ADN nouvellement synthétisés et l’autre contiendrait les deux brins parentaux, cela ne donnerait pas de molécules d’ADN hybrides dans l’expérience de Meselson-Stahl. L’hypothèse de réplication semiconservative a été soutenue dans la prochaine étape de l’expérience. Les cellules ont à nouveau été autorisées à doubler en nombre dans le milieu 14N. Le produit d’ADN isolé de ce second cycle de réplication exhibait deux bandes dans le gradient de densité, l’une avec une densité égale à celle de l’ADN léger et l’autre avec la densité de l’ADN hybride observée après le doublement de la première cellule.

La réplication commence à une origine et se poursuit de manière bidirectionnelle  :

Suite à la confirmation du mécanisme semi-conservateur de la réplication, une foule de questions ont surgi. Les brins d’ADN parents sont-ils complètement déroulés avant que chacun soit répliqué? La réplication commence-t-elle au hasard à un endroit ou à un point unique? Après l’initiation à un point donné
la réplication se poursuit elle dans une direction ou dans deux directions? Une indication précoce que la réplication est un processus hautement coordonnée dans lequel les brins parents sont simultanément déroulés et répliqués a été fourni par John Cairns .Il a créé des E. coli avec un ADN radioactif par culture de cellules dans un milieu contenant la thymidine marquée avec du tritium (3H). Quand l’ADN a été soigneusement isolé, étalé et recouvert d’une émulsion  photographique pendant plusieurs semaines, les résidus de thymidine ont généré des «traces» de grains d’argent, produisant une image de la molécule d’ADN. Ces traces ont révélé que le chromosome intact de E. coli est un grand cercle de 1,7 mm de long. L’ADN radioactif isolé des cellules durant la réplication a montré un boucle supplémentaire (figure 25-3a). Cairns a conclu que la boucle résulte de la formation de deux copies radioactives des brins, chacun complémentaire d’un brin parent. Un ou les deux extrémités de la boucle sont des points dynamiques, appelés fourches de réplication, où l’ADN parent est en train d’être déroulé et les brins séparés rapidement reproduits.

JOHN CAIRNS

Les résultats de Cairns ont démontré que les deux brins d’ADN sont répliqué simultanément, et une variation sur son expérience a indiqué que la réplication des chromosomes des batéries est bidirectionnelle: les deux extrémités de la boucle ont des fourches de réplication actives. Pour savoir si les boucles de réplication débutaient à un point unique dans les repères d’ADN a requis la connaissance de ces repères le long de la molécule d’ADN. Ceux-ci ont été fournis par une technique appelée cartographie de dénaturation, développé par Ross Inman et ses collègues. Utilisant le 48,502 pb chromosomes  du bactériophage λ, Inman a montré que L’ADN pourrait être sélectivement dénaturé à des séquences exceptionnellement riche en paires de bases A = T, générant un  modèle de bulles à simple brin reproductible :

inmad

ADN isolé contenant des boucles de réplication peut être partiellement dénaturé de la même manière. Cela permet la mesure et la cartographie des différentes position et la progression des fourches de réplication en utilisant les régions dénaturées comme des points de référence. La technique a révélé que dans ce système les boucles de réplication démarrent toujours à un point unique, qui a été appelé  l’origine. Il a également confirmé la précédente observation que la réplication est généralement bidirectionnelle. Pour les molécules d’ADN circulaires, les deux fourches de réplication se rencontrent à un point du côté du cercle opposé à l’origine. Les origines spécifiques de la réplication ont depuis été identifiées et caractérisées dans les bactéries et eucaryotes inférieures.
La synthèse d’ADN a lieu dans une direction 5 ‘→ 3′ et est semi-continue. Un nouveau brin d’ADN est toujours synthétisé dans le sens  5′ →3′, avec le 3′ OH libre comme le point à laquelle l’ADN est allongé. Parce que les deux brins d’ADN sont antiparallèles, le brin servant de modèle est lu à partir de son extrémité 3′ vers son extrémité 5′.
Si la synthèse se poursuit toujours dans le sens 5′→ 3′, comment les deux brins peuvent-ils être synthétisés simultanément? Si les deux brins sont synthétisés en continu pendant que la fourche de réplication se déplace, alors un brin devrait subir la synthèse de 3′→5′. Ce problème a été résolu par Reiji Okazaki et ses collègues dans les années 1960. Okazaki a trouvé que l’un des nouveaux brins d’ADN est synthétisé en petits  morceaux séparés, maintenant appelés fragments d’Okazaki. Ce travail finalement conduit à la conclusion qu’un brin est synthétisé en continu et l’autre en discontinu.

okazaki fragLe brin continu, ou brin principal, est celui dans lequel la synthèse se déroule dans le sens 5′→3′ c.à.d dans la même direction que le mouvement de la fourche de réplication. Le brin discontinu, ou brin secondaire (lagging), est celui dans lequel  la synthèse se déroule de 5′ →3′ mais dans la direction opposée à celle du mouvement de la fourche. Les fragments d’Okazaki ont une longueur de quelques centaines à quelques milliers de nucléotides, en fonction du type de cellule. La synthèses des brins leaders et secondaires est étroitement coordonné.

L’ADN est dégradé par les nucléases:

Pour expliquer l’enzymologie de la réplication de l’ADN, nous introduisons d’abord les enzymes qui dégradent l’ADN plutôt que de le synthétisent. Ces enzymes sont connues sous le nom de nucléases, ou DNases si elles sont spécifiques de l’ADN plutôt que de l’ARN. Chaque cellule contient plusieurs nucléases différentes, appartenant à deux grandes classes: les exonucléases et les endonucléases. Les exonucléases dégradent les acides nucléiques d’une
extrémité de la molécule. Beaucoup fonctionnent seulement dans le sens 5′ →3′ ou le sense opposé 3′ →5′, en enlevant des nucléotides seulement à partir de l’extrémité 5′ ou 3′, respectivement, d’un brin d’ADN double brin ou d’un ADN simple brin. Les endonucléases peuvent commencer à dégrader à des sites internes spécifiques dans un brin ou une molécule d’ADN, en le réduisant en fragments de plus en plus petits. Quelques exonucléases et endonucléases dégradent seulement l’ADN simple brin. Il existe quelques classes importantes d’endonucléases qui ne coupent qu’à des séquences nucléotidiques spécifiques (telles que les endonucléases de restriction qui sont si importantes en biotechnologie. Vous rencontrerez de nombreux types de nucléases dans ce chapitre et les suivants.

L’ADN est synthétisé par des ADN polymérases :

La recherche d’une enzyme capable de synthétiser l’ADN a commencé en 1955. Les travaux d’Arthur Kornberg et de ses collègues ont condui à la purification et à la caractérisation de l’ADN polymérase provenant des cellules d’ E. coli, une enzyme à polypeptide unique appelée maintenant ADN polymérase I. Beaucoup plus tard, les chercheurs ont découvert qu’E. coli contenaient au moins quatre autres ADN polymérases distinctes, décrites ci-dessous. Des études détaillées de l’ADN polymérase I ont révélé des caractéristiques du processus de synthèse de l’ADN qui sont maintenant connues pour être communes à toutes les ADN polymérases. La réaction fondamentale est un transfert de groupe phosphoryle :

dna pol 1

dNMP et dNTP sont désoxynucleoside 5′-monophosphate et 5′-triphosphate, respectivement. Le nucléophile est le groupe 3′-hydroxyle du nucléotide au niveau de l’extrémité 3′ du brin croissant. L’attaque nucléophile se produit au niveau du phosphore α du désoxynucléoside 5′-triphosphate entrant. Le pyrophosphate inorganique est libéré dans la réaction.

DNA POLY 4

La réaction semble se dérouler avec seulement un changement minime de l’énergie libre, étant donné qu’une liaison phosphodiester est formée aux dépens d’un anhydride phosphate un peu moins stable. Cependant, les interactions non-covalentes d’empilement de bases et d’appariements de bases fournissent une stabilisation supplémentaire au produit d’ADN allongé par rapport au nucléotide libre. En outre, la formation de produits est facilitée dans la cellule par les 19 kJ / mol générés lors de l’hydrolyse subséquente du produit pyrophosphate par l’enzyme pyrophosphatase.

Early work on DNA polymerase I led to the definition of two central requirements for DNA polymerization. First, all DNA polymerases require a template. The polymerization reaction is guided by a template DNA strand according to the base-pairing rules predicted by Watson and Crick: where a guanine is present in the template, a cytosine deoxynucleotide is added to the new strand, and so on. This was a particularly important discovery, not only because it provided a chemical basis for accurate semiconservative DNA replication but also because it represented the first example of the use of a template to guide a biosynthetic reaction. Second, the polymerases require a primer. A primer is a strand segment (complementary to the template) with a free 3-hydroxyl group to which a nucleotide can be added; the free 3 end of the primer is called the primer terminus. In other words, part of the new strand must already be in place: all DNA polymerases can only add nucleotides to a preexisting strand. Most primers are oligonucleotides of RNA rather than DNA, and specialized enzymes synthesize primers when and where they are required. After adding a nucleotide to a growing DNA strand, a DNA polymerase either dissociates or moves along the template and adds another nucleotide. Dissociation and reassociation of the polymerase can limit the overall polymerization rate—the process is generally faster when a polymerase adds more nucleotides without dissociating from the template. The average number of nucleotides added before a polymerase dissociates defines its processivity. DNA polymerases vary greatly in processivity; some add just a few nucleotides before dissociating, others add many thousands. Nucleotide Polymerization by DNA Polymerase Replication Is Very Accurate Replication proceeds with an extraordinary degree of fidelity. In E. coli, a mistake is made only once for every 109 to 1010 nucleotides added. For the E. coli chromosome
of ~4.6  106 bp, this means that an error occurs only once per 1,000 to 10,000 replications. During polymerization, discrimination between correct and incorrect nucleotides relies not just on the hydrogen bonds that specify the correct pairing between complementary bases but also on the common geometry of the standard AUT and GmC base pairs (Fig. 25–6). The active site of DNA polymerase I accommodates only base pairs with this geometry. An incorrect nucleotide may be able to hydrogen-bond with a base in the template, but it generally will not fit into the active site. Incorrect bases can be rejected before the phosphodiester bond is formed. The accuracy of the polymerization reaction itself, however, is insufficient to account for the high degree of fidelity in replication. Careful measurements in vitro have shown that DNA polymerases insert one incorrect nucleotide for every 104 to 105 correct ones. These mistakes sometimes occur because a base is briefly in an unusual tautomeric form (see Fig. 8–9), allowing it to hydrogen-bond with an incorrect partner. In vivo, the error rate is reduced by additional enzymatic mechanisms. One mechanism intrinsic to virtually all DNA polymerases is a separate 3n5 exonuclease activity that double-checks each nucleotide after it is added. This nuclease activity permits the enzyme to remove a newly added nucleotide and is highly specific for mismatched base pairs (Fig. 25–7). If the polymerase has added the wrong nucleotide, translocation of the enzyme to the position where the next nucleotide is to be added is inhibited. This kinetic pause provides the opportunity for a correction. The 3n5 exonuclease activity removes the mispaired nucleotide, and the polymerase begins again. This activity, known as proofreading, is not simply the reverse of the polymerization reaction (Eqn 25–1), because pyrophosphate is not involved. The polymerizing and proofreading activities of a DNA polymerase can be measured separately. Proofreading improves the inherent accuracy of the polymerization reaction 102- to 103-fold. In the monomeric DNA polymerase I, the polymerizing and proofreading activities have separate active sites within the same polypeptide. When base selection and proofreading are combined, DNA polymerase leaves behind one net error for every 106 to 108 bases added. Yet the measured accuracy of replication in E. coli is higher still. The additional accuracy is provided by a separate enzyme system that repairs the mismatched base pairs remaining after replication. We describe this mismatch repair,
along with other DNA repair processes, in Section 25.2.
E. coli Has at Least Five DNA Polymerases
More than 90% of the DNA polymerase activity observed
in E. coli extracts can be accounted for by DNA polymerase
I. Soon after the isolation of this enzyme in 1955,
however, evidence began to accumulate that it is not
suited for replication of the large E. coli chromosome.
First, the rate at which it adds nucleotides (600 nucleotides/
min) is too slow (by a factor of 100 or more)
to account for the rates at which the replication fork
moves in the bacterial cell. Second, DNA polymerase I
has a relatively low processivity. Third, genetic studies
have demonstrated that many genes, and therefore
many proteins, are involved in replication: DNA polymerase
I clearly does not act alone. Fourth, and most
important, in 1969 John Cairns isolated a bacterial strain
with an altered gene for DNA polymerase I that produced
an inactive enzyme. Although this strain was abnormally
sensitive to agents that damaged DNA, it was
nevertheless viable!
A search for other DNA polymerases led to the
discovery of E. coli DNA polymerase II and DNA
polymerase III in the early 1970s. DNA polymerase II
is an enzyme involved in one type of DNA repair (Section
25.3). DNA polymerase III is the principal replication
enzyme in E. coli. The properties of these three
DNA polymerases are compared in Table 25–1. DNA
25.1 DNA Replication 955
DNA polymerase I
OH
Before the polymerase
moves on, the cytosine
undergoes a tautomeric
shift from C* to C. The
new nucleotide is now
mispaired.
is a rare tautomeric
form of cytosine (C*)
that pairs with A and
is incorporated into
the growing strand.
The mispaired 3-OH
end of the growing
strand blocks further
elongation. DNA
polymerase slides back
to position the
mispaired base in the
3→5 exonuclease
active site.
The mispaired
nucleotide is removed.
DNA polymerase slides
forward and resumes its
polymerization activity.
DNA polymerase
active site
3→5 (proofreading)
exonuclease

FIGURE 25–7 An example of error correction by the 3n5 exonuclease
activity of DNA polymerase I. Structural analysis has located
the exonuclease activity ahead of the polymerase activity as the enzyme
is oriented in its movement along the DNA. A mismatched base
(here, a C–A mismatch) impedes translocation of DNA polymerase I
to the next site. Sliding backward, the enzyme corrects the mistake
with its 3n5 exonuclease activity, then resumes its polymerase activity
in the 5n3 direction.
polymerases IV and V, identified in 1999, are involved
in an unusual form of DNA repair (Section 25.2).
DNA polymerase I, then, is not the primary enzyme
of replication; instead it performs a host of clean-up
functions during replication, recombination, and repair.
The polymerase’s special functions are enhanced by its
5n3 exonuclease activity. This activity, distinct from
the 3n5 proofreading exonuclease (Fig. 25–7), is located
in a structural domain that can be separated from
the enzyme by mild protease treatment. When the
5n3 exonuclease domain is removed, the remaining
fragment (Mr 68,000), the large fragment or Klenow
fragment (Fig. 25–8), retains the polymerization and
proofreading activities. The 5n3 exonuclease activity
of intact DNA polymerase I can replace a segment of
DNA (or RNA) paired to the template strand, in a
process known as nick translation (Fig. 25–9). Most
other DNA polymerases lack a 5n3 exonuclease
activity.
DNA polymerase III is much more complex than
DNA polymerase I, having ten types of subunits (Table
25–2). Its polymerization and proofreading activities reside
in its  and  (epsilon) subunits, respectively. The
 subunit associates with  and  to form a core polymerase,
which can polymerize DNA but with limited
processivity. Two core polymerases can be linked by
956 Chapter 25 DNA Metabolism
TABLE 25–1 Comparison of DNA Polymerases of E. coli
DNA polymerase
I II III
Structural gene* polA polB polC (dnaE)
Subunits (number of different types) 1 7 10
Mr 103,000 88,000† 791,500
3n5 Exonuclease (proofreading) Yes Yes Yes
5n3 Exonuclease Yes No No
Polymerization rate (nucleotides/s) 16–20 40 250–1,000
Processivity (nucleotides added 3–200 1,500 500,000
before polymerase dissociates)
*For enzymes with more than one subunit, the gene listed here encodes the subunit with polymerization activity. Note that dnaE
is an earlier designation for the gene now referred to as polC.
†Polymerization subunit only. DNA polymerase II shares several subunits with DNA polymerase III, including the , , , , ,
and
subunits (see Table 25–2).
TABLE 25–2 Subunits of DNA Polymerase III of E. coli
Number of
subunits per
Subunit holoenzyme Mr of subunit Gene Function of subunit
 2 129,900 polC (dnaE) Polymerization activity
 2 27,500 dnaQ (mutD) 3n5 Proofreading exonuclease Core polymerase
 2 8,600 holE
2 71,100 dnaX Stable template binding;
core enzyme dimerization Clamp-loading () complex that
 1 47,500 dnaX* Clamp loader loads  subunits on lagging
 1 38,700 holA Clamp opener strand at each Okazaki fragment
 1 36,900 holB Clamp loader
1 16,600 holC Interaction with SSB

1 15,200 holD Interaction with  and
 4 40,600 dnaN DNA clamp required for
optimal processivity
*The  subunit is encoded by a portion of the gene for the subunit, such that the amino-terminal 66% of the subunit has
the same amino acid sequence as the  subunit. The  subunit is generated by a translational frameshifting mechanism (see
Box 27–1) that leads to premature translational termination.


another set of subunits, a clamp-loading complex, or 
complex, consisting of five subunits of four different
types, 2. The core polymerases are linked through
the  (tau) subunits. Two additional subunits,  (chi) and
 (psi), are bound to the clamp-loading complex. The
entire assembly of 13 protein subunits (nine different
types) is called DNA polymerase III* (Fig. 25–10a).
DNA polymerase III* can polymerize DNA, but with
a much lower processivity than one would expect for
the organized replication of an entire chromosome. The
necessary increase in processivity is provided by the addition
of the  subunits, four of which complete the DNA
polymerase III holoenzyme. The  subunits associate in
pairs to form donut-shaped structures that encircle the
DNA and act like clamps (Fig. 25–10b). Each dimer associates
with a core subassembly of polymerase III* (one
dimeric clamp per core subassembly) and slides along
the DNA as replication proceeds. The  sliding clamp
prevents the dissociation of DNA polymerase III from
DNA, dramatically increasing processivity—to greater
than 500,000 (Table 25–1).
DNA Replication Requires Many Enzymes
and Protein Factors
Replication in E. coli requires not just a single DNA
polymerase but 20 or more different enzymes and proteins,
each performing a specific task. The entire complex
has been termed the DNA replicase system or
replisome. The enzymatic complexity of replication reflects
the constraints imposed by the structure of DNA
and by the requirements for accuracy. The main classes
of replication enzymes are considered here in terms of
the problems they overcome.
Access to the DNA strands that are to act as templates
requires separation of the two parent strands.
This is generally accomplished by helicases, enzymes
that move along the DNA and separate the strands, using
chemical energy from ATP. Strand separation creates
topological stress in the helical DNA structure (see
Fig. 24–12), which is relieved by the action of topoisomerases.
The separated strands are stabilized by
DNA-binding proteins. As noted earlier, before DNA
polymerases can begin synthesizing DNA, primers must
be present on the template—generally short segments
25.1 DNA Replication 957

polymerase I
FIGURE 25–8 Large (Klenow) fragment of DNA polymerase I. This
polymerase is widely distributed in bacteria. The Klenow fragment,
produced by proteolytic treatment of the polymerase, retains the polymerization
and proofreading activities of the enzyme. The Klenow
fragment shown here is from the thermophilic bacterium Bacillus
stearothermophilus (PDB ID 3BDP). The active site for addition of nucleotides
is deep in the crevice at the far end of the bound DNA. The
dark blue strand is the template.
FIGURE 25–9 Nick translation. In this process, an RNA or DNA strand
paired to a DNA template is simultaneously degraded by the 5n3
exonuclease activity of DNA polymerase I and replaced by the polymerase
activity of the same enzyme. These activities have a role in
both DNA repair and the removal of RNA primers during replication
(both described later). The strand of nucleic acid to be removed (either
DNA or RNA) is shown in green, the replacement strand in red.
DNA synthesis begins at a nick (a broken phosphodiester bond, leaving
a free 3 hydroxyl and a free 5 phosphate). Polymerase I extends
the nontemplate DNA strand and moves the nick along the DNA—a
process called nick translation. A nick remains where DNA polymerase
I dissociates, and is later sealed by another enzyme.
End view
of RNA synthesized by enzymes known as primases.
Ultimately, the RNA primers are removed and replaced
by DNA; in E. coli, this is one of the many functions of
DNA polymerase I. After an RNA primer is removed and
the gap is filled in with DNA, a nick remains in the DNA
backbone in the form of a broken phosphodiester bond.
These nicks are sealed by DNA ligases. All these
processes require coordination and regulation, an interplay
best characterized in the E. coli system.
Replication of the E. coli Chromosome
Proceeds in Stages
The synthesis of a DNA molecule can be divided into
three stages: initiation, elongation, and termination,
distinguished both by the reactions taking place and by
the enzymes required. As you will find here and in the
next two chapters, synthesis of the major informationcontaining
biological polymers—DNAs, RNAs, and proteins—
can be understood in terms of these same three
stages, with the stages of each pathway having unique
characteristics. The events described below reflect information
derived primarily from in vitro experiments
using purified E. coli proteins, although the principles
are highly conserved in all replication systems.
Initiation The E. coli replication origin, oriC, consists
of 245 bp; it bears DNA sequence elements that are
highly conserved among bacterial replication origins.
The general arrangement of the conserved sequences is
958 Chapter 25 DNA Metabolism
t
b clamp
DnaB
helicase
t
b clamp
(open)
Core (aev)
d
g
d
FIGURE 25–10 DNA polymerase III. (a) Architecture of bacterial
DNA polymerase III. Two core domains, composed of subunits , ,
and , are linked by a five-subunit  complex (also known as the
clamp-loading complex) with the composition 2. The  and 
subunits are encoded by the same gene. The  subunit is a shortened
version of ; the  subunit thus contains a domain identical to , along
with an additional segment that interacts with the core polymerase.
The other two subunits of DNA polymerase III*,  and (not shown),
also bind to the  complex. Two
clamps interact with the two-core
subassembly, each clamp a dimer of the
subunit. The complex interacts
with the DnaB helicase through the  subunit. (b) Two
subunits
of E. coli polymerase III form a circular clamp that surrounds the
DNA. The clamp slides along the DNA molecule, increasing the processivity
of the polymerase III holoenzyme to greater than 500,000 by
preventing its dissociation from the DNA. The end-on view shows the
two
subunits as gray and light-blue ribbon structures surrounding a
space-filling model of DNA. In the side view, surface contour models
of the
subunits (gray) surround a stick representation of a DNA double
helix (light and dark blue) (derived from PDB ID 2POL). Side view
(b)
(a)
illustrated in Figure 25–11. The key sequences of interest
here are two series of short repeats: three repeats
of a 13 bp sequence and four repeats of a 9 bp sequence.
At least nine different enzymes or proteins (summarized
in Table 25–3) participate in the initiation phase
of replication. They open the DNA helix at the origin
and establish a prepriming complex for subsequent reactions.
The crucial component in the initiation process
is the DnaA protein. A single complex of four to five
DnaA protein molecules binds to the four 9 bp repeats
in the origin (Fig. 25–12, step 1 ), then recognizes and
successively denatures the DNA in the region of the
three 13 bp repeats, which are rich in AUT pairs (step
2 ). This process requires ATP and the bacterial histonelike
protein HU. The DnaC protein then loads the
DnaB protein onto the unwound region. Two ringshaped
hexamers of DnaB, one loaded onto each DNA
strand, act as helicases, unwinding the DNA bidirectionally
and creating two potential replication forks. If
the E. coli single-stranded DNA–binding protein (SSB)
and DNA gyrase (DNA topoisomerase II) are now added
in vitro, thousands of base pairs are rapidly unwound
by the DnaB helicase, proceeding out from the origin.
Many molecules of SSB bind cooperatively to singlestranded
DNA, stabilizing the separated strands and
preventing renaturation while gyrase relieves the topological
stress produced by the DnaB helicase. When additional
replication proteins are included in the in vitro
system, the DNA unwinding mediated by DnaB is coupled
to replication, as described below.
Initiation is the only phase of DNA replication that
is known to be regulated, and it is regulated such that
replication occurs only once in each cell cycle. The
mechanism of regulation is not yet well understood, but
genetic and biochemical studies have provided a few
insights.
The timing of replication initiation is affected by
DNA methylation and interactions with the bacterial
plasma membrane. The oriC DNA is methylated by the
Dam methylase (Table 25–3), which methylates the N6
position of adenine within the palindromic sequence
(5)GATC. (Dam is not a biochemical expletive; it stands
for DNA adenine methylation.) The oriC region of E. coli
is highly enriched in GATC sequences—it has 11 of them
in its 245 bp, whereas the average frequency of GATC in
the E. coli chromosome as a whole is 1 in 256 bp.
25.1 DNA Replication 959
Tandem array of
three 13 bp sequences
Binding sites for DnaA protein,
four 9 bp sequences
Consensus sequence
TTATCCACA
Consensus sequence
GATCTNTTNTTTT
FIGURE 25–11 Arrangement of sequences in the E. coli replication
origin, oriC. Although the repeated sequences (shaded in color) are
not identical, certain nucleotides are particularly common in each position,
forming a consensus sequence. In positions where there is no
consensus, N represents any of the four nucleotides. The arrows indicate
the orientations of the nucleotide sequences.
1
2
3
DnaB helicase
Priming and
replication
DnaB
DnaC
HU
DnaA
Supercoiled
template
Three 13 bp
repeats
Four 9 bp
repeats
oriC
 ATP
 ATP
 ATP
FIGURE 25–12 Model for initiation of replication at the E. coli origin,
oriC. 1 About 20 DnaA protein molecules, each with a bound
ATP, bind at the four 9 bp repeats. The DNA is wrapped around this
complex. 2 The three AUT-rich 13 bp repeats are denatured sequentially.
3 Hexamers of the DnaB protein bind to each strand,
with the aid of DnaC protein. The DnaB helicase activity further unwinds
the DNA in preparation for priming and DNA synthesis.
Immediately after replication, the DNA is hemimethylated:
the parent strands have methylated oriC
sequences but the newly synthesized strands do not. The
hemimethylated oriC sequences are now sequestered
for a period by interaction with the plasma membrane
(the mechanism is unknown). After a time, oriC is released
from the plasma membrane, and it must be fully
methylated by Dam methylase before it can again bind
DnaA. Regulation of initiation also involves the slow hydrolysis
of ATP by DnaA protein, which cycles the protein
between active (with bound ATP) and inactive (with
bound ADP) forms on a timescale of 20 to 40 minutes.
Elongation The elongation phase of replication includes
two distinct but related operations: leading strand synthesis
and lagging strand synthesis. Several enzymes at
the replication fork are important to the synthesis of both
strands. Parent DNA is first unwound by DNA helicases,
and the resulting topological stress is relieved by topoisomerases.
Each separated strand is then stabilized by
960 Chapter 25 DNA Metabolism
TABLE 25–3 Proteins Required to Initiate Replication at the E. coli Origin
Number of
Protein Mr subunits Function
DnaA protein 52,000 1 Recognizes ori sequence; opens duplex at specific sites in
origin
DnaB protein (helicase) 300,000 6* Unwinds DNA
DnaC protein 29,000 1 Required for DnaB binding at origin
HU 19,000 2 Histonelike protein; DNA-binding protein; stimulates initiation
Primase (DnaG protein) 60,000 1 Synthesizes RNA primers
Single-stranded DNA–binding
protein (SSB) 75,600 4* Binds single-stranded DNA
RNA polymerase 454,000 5 Facilitates DnaA activity
DNA gyrase (DNA topoisomerase II) 400,000 4 Relieves torsional strain generated by DNA unwinding
Dam methylase 32,000 1 Methylates (5)GATC sequences at oriC
FIGURE 25–13 Synthesis of Okazaki
fragments. (a) At intervals, primase
synthesizes an RNA primer for a new
Okazaki fragment. Note that if we
consider the two template strands as
lying side by side, lagging strand
synthesis formally proceeds in the
opposite direction from fork movement.
(b) Each primer is extended by DNA
polymerase III. (c) DNA synthesis
continues until the fragment extends as
far as the primer of the previously added
Okazaki fragment. A new primer is
synthesized near the replication fork to
begin the process again.
5
3
5
3
5
3
Replication fork movement
Leading strand synthesis
(DNA polymerase III)
DnaB
helicase
DNA topoisomerase II
(DNA gyrase)
Lagging
strand
Lagging strand synthesis
(DNA polymerase III)
RNA SSB
primer
DNA
primase
(a)
(c)
(b)
RNA primer
from previous
Okazaki
fragment
*Subunits in these cases are identical.
SSB. From this point, synthesis of leading and lagging
strands is sharply different.
Leading strand synthesis, the more straightforward
of the two, begins with the synthesis by primase (DnaG
protein) of a short (10 to 60 nucleotide) RNA primer at
the replication origin. Deoxyribonucleotides are added
to this primer by DNA polymerase III. Leading strand
synthesis then proceeds continuously, keeping pace
with the unwinding of DNA at the replication fork.
Lagging strand synthesis, as we have noted, is accomplished
in short Okazaki fragments. First, an RNA
primer is synthesized by primase and, as in leading
strand synthesis, DNA polymerase III binds to the RNA
primer and adds deoxyribonucleotides (Fig. 25–13). On
this level, the synthesis of each Okazaki fragment seems
straightforward, but the reality is quite complex. The
complexity lies in the coordination of leading and lagging
strand synthesis: both strands are produced by a
single asymmetric DNA polymerase III dimer, which is
accomplished by looping the DNA of the lagging strand
as shown in Figure 25–14, bringing together the two
points of polymerization.
25.1 DNA Replication 961
DnaB
Core
Clamp-loading complex
with open b sliding clamp
Lagging strand
RNA primer
of previous
Okazaki
fragment
Leading
strand
(a) Continuous synthesis on the leading strand proceeds
as DNA is unwound by the DnaB helicase.
Primase
New
RNA
primer
Primer of previous
Okazaki fragment
approaches core
subunits
(b) DNA primase binds to DnaB, synthesizes
a new primer, then dissociates.
Primase
Discarded
b clamp
The next b clamp
is readied
New b clamp is loaded
onto new template primer
Synthesis of new
Okazaki fragment
is completed
(c)
New b clamp
(e)
(d)
FIGURE 25–14 DNA synthesis on the leading
and lagging strands. Events at the replication fork
are coordinated by a single DNA polymerase III
dimer, in an integrated complex with DnaB
helicase. This figure shows the replication
process already underway (parts (a) through (e)
are discussed in the text). The lagging strand is
looped so that DNA synthesis proceeds steadily
on both the leading and lagging strand templates
at the same time. Red arrows indicate the 3 end
of the two new strands and the direction of DNA
synthesis. Black arrows show the direction of
movement of the parent DNA through the
complex. An Okazaki fragment is being
synthesized on the lagging strand.
The synthesis of Okazaki fragments on the lagging
strand entails some elegant enzymatic choreography.
The DnaB helicase and DnaG primase constitute a functional
unit within the replication complex, the primosome.
DNA polymerase III uses one set of its core subunits
(the core polymerase) to synthesize the leading
strand continuously, while the other set of core subunits
cycles from one Okazaki fragment to the next on the
looped lagging strand. The DnaB helicase unwinds the
DNA at the replication fork (Fig. 25–14a) as it travels
along the lagging strand template in the 5n3 direction.
DNA primase occasionally associates with DnaB
helicase and synthesizes a short RNA primer (Fig.
25–14b). A new  sliding clamp is then positioned at the
primer by the clamp-loading complex of DNA polymerase
III (Fig. 25–14c). When synthesis of an Okazaki
fragment has been completed, replication halts, and the
core subunits of DNA polymerase III dissociate from
their  sliding clamp (and from the completed Okazaki
fragment) and associate with the new clamp (Fig.
25–14d, e). This initiates synthesis of a new Okazaki
fragment. As noted earlier, the entire complex responsible
for coordinated DNA synthesis at a replication fork
is a replisome. The proteins acting at the replication
fork are summarized in Table 25–4.
The replisome promotes rapid DNA synthesis,
adding ~1,000 nucleotides/s to each strand (leading and
lagging). Once an Okazaki fragment has been completed,
its RNA primer is removed and replaced with
DNA by DNA polymerase I, and the remaining nick is
sealed by DNA ligase (Fig. 25–15).
DNA ligase catalyzes the formation of a phosphodiester
bond between a 3 hydroxyl at the end of one
DNA strand and a 5 phosphate at the end of another
strand. The phosphate must be activated by adenylylation.
DNA ligases isolated from viruses and eukaryotes
use ATP for this purpose. DNA ligases from bacteria are
unusual in that they generally use NAD—a cofactor
that normally functions in hydride transfer reactions
(see Fig. 13–15)—as the source of the AMP activating
group (Fig. 25–16). DNA ligase is another enzyme of
DNA metabolism that has become an important reagent
in recombinant DNA experiments (see Fig. 9–1).
Termination Eventually, the two replication forks of the
circular E. coli chromosome meet at a terminus region
containing multiple copies of a 20 bp sequence called
Ter (for terminus) (Fig. 25–17a). The Ter sequences are
arranged on the chromosome to create a sort of trap
that a replication fork can enter but cannot leave. The
Ter sequences function as binding sites for a protein
called Tus (terminus utilization substance). The Tus-Ter
complex can arrest a replication fork from only one direction.
Only one Tus-Ter complex functions per replication
cycle—the complex first encountered by either
962 Chapter 25 DNA Metabolism
TABLE 25–4 Proteins at the E. coli Replication Fork
Number of
Protein Mr subunits Function
SSB 75,600 4 Binding to single-stranded DNA
DnaB protein (helicase) 300,000 6 DNA unwinding; primosome constituent
Primase (DnaG protein) 60,000 1 RNA primer synthesis; primosome constituent
DNA polymerase III 791,500 17 New strand elongation
DNA polymerase I 103,000 1 Filling of gaps; excision of primers
DNA ligase 74,000 1 Ligation
DNA gyrase (DNA topoisomerase II) 400,000 4 Supercoiling
Modified from Kornberg, A. (1982) Supplement to DNA Replication, Table S11–2, W. H. Freeman and Company, New York.
3 5
5 3
Lagging
strand
dNTPs
rNMPs DNA polymerase I Nick
ATP (or NAD+)
AMP +PPi (or NMN)
DNA ligase
FIGURE 25–15 Final steps in the synthesis of lagging strand segments.
RNA primers in the lagging strand are removed by the 5n3
exonuclease activity of DNA polymerase I and replaced with DNA by
the same enzyme. The remaining nick is sealed by DNA ligase. The
role of ATP or NAD is shown in Figure 25–16.
O
PPi (from ATP)
or
NMN (from NAD)
Enzyme P O
O
O
Ribose Adenine
Enzyme
P
O
DNA ligase
OH O
Nick in DNA
Enzyme-AMP
NH3

O
P
OH O O
O O
P
O
O O
DNA ligase
P
O
O
O
Ribose Adenine
AMP
O P
O
O
Sealed DNA
Ribose Adenine
R O P O
O
O
Ribose Adenine
AMP from ATP (R  PPi)
or NAD (R  NMN)
NH2

O O
Enzyme NH3

1 Adenylylation of
DNA ligase
2 Activation of
5 phosphate in
nick
5
3
3
5
3 Displacement of AMP seals nick
replication fork. Given that opposing replication forks
generally halt when they collide, Ter sequences do not
seem essential, but they may prevent overreplication by
one replication fork in the event that the other is delayed
or halted by an encounter with DNA damage or
some other obstacle.
So, when either replication fork encounters a functional
Tus-Ter complex, it halts; the other fork halts
when it meets the first (arrested) fork. The final few
hundred base pairs of DNA between these large protein
complexes are then replicated (by an as yet unknown
mechanism), completing two topologically interlinked
(catenated) circular chromosomes (Fig. 25–17b). DNA
circles linked in this way are known as catenanes. Separation
of the catenated circles in E. coli requires topoisomerase
IV (a type II topoisomerase). The separated
chromosomes then segregate into daughter cells at cell
division. The terminal phase of replication of other circular
chromosomes, including many of the DNA viruses
that infect eukaryotic cells, is similar.
Bacterial Replication Is Organized in Membrane-
Bound Replication Factories
The replication of a circular bacterial chromosome is
highly organized. Once bidirectional replication is initiated
at the origin, the two replisomes do not travel away
from each other along the DNA. Instead, the replisomes
are linked together and tethered to one point on the
bacterial inner membrane, and the DNA substrate is fed
through this “replication factory” (Fig. 25–18a). The
tethering point is at the center of the elongated bacterial
cell. After initiation, each of the two newly synthesized
replication origins is partitioned into one half of
25.1 DNA Replication 963
FIGURE 25–16 Mechanism of the DNA ligase reaction. In each of
the three steps, one phosphodiester bond is formed at the expense of
another. Steps 1 and 2 lead to activation of the 5 phosphate in
the nick. An AMP group is transferred first to a Lys residue on the enzyme
and then to the 5 phosphate in the nick. In step 3 , the 3-
hydroxyl group attacks this phosphate and displaces AMP, producing a
phosphodiester bond to seal the nick. In the E. coli DNA ligase reaction,
AMP is derived from NAD. The DNA ligases isolated from a
number of viral and eukaryotic sources use ATP rather than NAD,
and they release pyrophosphate rather than nicotinamide mononucleotide
(NMN) in step 1 .
(a)
Origin
Clockwise
fork
Counterclockwise
Clockwise fork trap
fork trap
Counterclockwise
fork
TerG
TerF
TerB TerC
TerA
TerD
TerB
Clockwise
fork
Counterclockwise
fork
completion
of replication
Catenated
chromosomes
Separated
chromosomes
(b)
DNA topoisomerase IV
the cell, and continuing replication extrudes each new
chromosome into that half (Fig. 25–18b). The elaborate
spatial organization of the newly replicated chromosomes
is orchestrated and maintained by many proteins,
including bacterial homologs of the SMC proteins and
topoisomerases (Chapter 24). Once replication is terminated,
the cell divides, and the chromosomes sequestered
in the two halves of the original cell are accurately
partitioned into the daughter cells. When
replication commences in the daughter cells, the origin
of replication is sequestered in new replication factories
formed at a point on the membrane at the center of the
cell, and the entire process is repeated.
Replication in Eukaryotic Cells Is More Complex
The DNA molecules in eukaryotic cells are considerably
larger than those in bacteria and are organized into complex
nucleoprotein structures (chromatin; p. 938). The
essential features of DNA replication are the same in
eukaryotes and prokaryotes, and many of the protein
complexes are functionally and structurally conserved.
However, some interesting variations on the general
principles discussed above promise new insights into the
regulation of replication and its link with the cell cycle.
Origins of replication, called autonomously replicating
sequences (ARS) or replicators, have been
identified and best studied in yeast. Yeast replicators
span ~150 bp and contain several essential conserved
sequences. About 400 replicators are distributed among
the 16 chromosomes in a haploid yeast genome. Initiation
of replication in all eukaryotes requires a multisubunit
protein, the origin recognition complex (ORC),
which binds to several sequences within the replicator.
ORC interacts with and is regulated by a number of
other proteins involved in control of the eukaryotic cell
cycle. Two other proteins, CDC6 (discovered in a screen
for genes affecting the cell division cycle) and CDT1
(Cdc10-dependent transcript 1), bind to ORC and mediate
the loading of a heterohexamer of minichromosome
maintenance proteins (MCM2 to MCM7). The
MCM complex is a ring-shaped replicative helicase, analogous
to the bacterial DnaB helicase. The CDC6 and
CDT1 proteins have a role comparable to that of the
bacterial DnaC protein, loading the MCM helicase onto
the DNA near the replication origin.
The rate of replication fork movement in eukaryotes
(~50 nucleotides/s) is only one-twentieth that observed
in E. coli. At this rate, replication of an average
human chromosome proceeding from a single origin
964 Chapter 25 DNA Metabolism
FIGURE 25–17 Termination of chromosome replication in
E. coli. (a) The Ter sequences are positioned on the chromosome
in two clusters with opposite orientations. (b) Replication
of the DNA separating the opposing replication forks leaves the
completed chromosomes joined as catenanes, or topologically
interlinked circles. The circles are not covalently linked, but
because they are interwound and each is covalently closed,
they cannot be separated—except by the action of topoisomerases.
In E. coli, a type II topoisomerase known as DNA
topoisomerase IV plays the primary role in the separation of
catenated chromosomes, transiently breaking both DNA strands
of one chromosome and allowing the other chromosome to pass
through the break.
35
53
(a)
would take more than 500 hours. Replication of human
chromosomes in fact proceeds bidirectionally from
many origins, spaced 30,000 to 300,000 bp apart. Eukaryotic
chromosomes are almost always much larger
than bacterial chromosomes, so multiple origins are
probably a universal feature in eukaryotic cells.
Like bacteria, eukaryotes have several types of
DNA polymerases. Some have been linked to particular
functions, such as the replication of mitochondrial
DNA. The replication of nuclear chromosomes involves
DNA polymerase , in association with DNA polymerase
. DNA polymerase  is typically a multisubunit
enzyme with similar structure and properties in all
eukaryotic cells. One subunit has a primase activity, and
the largest subunit (Mr ~180,000) contains the polymerization
activity. However, this polymerase has no
proofreading 3n5 exonuclease activity, making it unsuitable
for high-fidelity DNA replication. DNA polymerase
 is believed to function only in the synthesis
of short primers (containing either RNA or DNA) for
Okazaki fragments on the lagging strand. These primers
are then extended by the multisubunit DNA polymerase
. This enzyme is associated with and stimulated
by a protein called proliferating cell nuclear antigen
(PCNA; Mr 29,000), found in large amounts in the
nuclei of proliferating cells. The three-dimensional
structure of PCNA is remarkably similar to that of the
 subunit of E. coli DNA polymerase III (Fig. 25–10b),
although primary sequence homology is not evident.
PCNA has a function analogous to that of the  subunit,
forming a circular clamp that greatly enhances the
processivity of the polymerase. DNA polymerase  has
a 3n5 proofreading exonuclease activity and appears
to carry out both leading and lagging strand synthesis
in a complex comparable to the dimeric bacterial DNA
polymerase III.
Yet another polymerase, DNA polymerase , replaces
DNA polymerase  in some situations, such as in
DNA repair. DNA polymerase  may also function at the
replication fork, perhaps playing a role analogous to that
of the bacterial DNA polymerase I, removing the primers
of Okazaki fragments on the lagging strand.
25.1 DNA Replication 965
Origin
Bacterium
Replisome
replication
begins
origins
separate
cell elongates
as replication
continues
chromosomes
separate
cells
divide
Terminator
(b)
Chromosome
FIGURE 25–18 Chromosome partitioning
in bacteria. (a) All replication is carried
out at a central replication factory that
includes two complete replication forks.
(b) The two replicated copies of the
bacterial chromosome are extruded from
the replication factory into the two halves
of the cell, possibly with each newly
synthesized origin bound separately to
different points on the plasma membrane.
Sequestering the two chromosome copies
in separate cell halves facilitates their
proper segregation at cell division.
Many DNA viruses encode their own DNA polymerases,
and some of these have become targets for
pharmaceuticals. For example, the DNA polymerase of
the herpes simplex virus is inhibited by acyclovir, a compound
developed by Gertrude Elion (p. 876). Acyclovir
consists of guanine attached to an incomplete ribose
ring. It is phosphorylated by a virally encoded thymidine
kinase; acyclovir binds to this viral enzyme with an
affinity 200-fold greater than its binding to the cellular
thymidine kinase. This ensures that phosphorylation occurs
mainly in virus-infected cells. Cellular kinases convert
the resulting acyclo-GMP to acyclo-GTP, which is
both an inhibitor and a substrate of DNA polymerases,
and which competitively inhibits the herpes DNA polymerase
more strongly than cellular DNA polymerases.
Because it lacks a 3 hydroxyl, acyclo-GTP also acts as
a chain terminator when incorporated into DNA. Thus
viral replication is inhibited at several steps.
Two other protein complexes also function in eukaryotic
DNA replication. RPA (replication protein A)
is a eukaryotic single-stranded DNA–binding protein,
equivalent in function to the E. coli SSB protein. RFC
(replication factor C) is a clamp loader for PCNA and
facilitates the assembly of active replication complexes.
The subunits of the RFC complex have significant sequence
similarity to the subunits of the bacterial clamploading
() complex.
The termination of replication on linear eukaryotic
chromosomes involves the synthesis of special structures
called telomeres at the ends of each chromosome,
as discussed in the next chapter.
SUMMARY 25.1 DNA Replication
■ Replication of DNA occurs with very high
fidelity and at a designated time in the cell
cycle. Replication is semiconservative, each
strand acting as template for a new daughter
strand. It is carried out in three identifiable
phases: initiation, elongation, and termination.
The reaction starts at the origin and usually
proceeds bidirectionally.
■ DNA is synthesized in the 5n3 direction by
DNA polymerases. At the replication fork, the
leading strand is synthesized continuously in
the same direction as replication fork
movement; the lagging strand is synthesized
discontinuously as Okazaki fragments, which
are subsequently ligated.
HN
N N
O
O
OH
H2N
N
■ The fidelity of DNA replication is maintained
by (1) base selection by the polymerase, (2) a
3n5 proofreading exonuclease activity that is
part of most DNA polymerases, and (3) specific
repair systems for mismatches left behind after
replication.
■ Most cells have several DNA polymerases. In
E. coli, DNA polymerase III is the primary
replication enzyme. DNA polymerase I is
responsible for special functions during
replication, recombination, and repair.
■ Replication of the E. coli chromosome involves
many enzymes and protein factors organized in
replication factories, in which template DNA is
spooled through two replisomes tethered to the
bacterial plasma membrane.
■ Replication is similar in eukaryotic cells, but
eukaryotic chromosomes have many replication
origins.

Chapitre 1: Biochimie – Introduction et lipides

La biochimie est un domaine de la chimie lié aux corps vivants, animaux ou végétaux. Ce champ est loin de la chimie inorganique et une simple comparaison peut le montrer: la répartition des molécules dans la croûte terrestre et dans un corps vivant est totalement différente. Le premier est essentiellement composé de silice et le second de carbone.

bioc3

Historiquement, la première théorie sur la vie était qu’elle est donnée par Dieu et seulement par Lui. Les molécules sont inanimées et ne peuvent pas être transformées en un corps vivant sauf si Dieu y insuffle la vie. C’est ce qu’on appelle la théorie du vitalisme.

Miller a montré à travers ses expériences qu’il était possible de créer des molécules appartenant à des corps vivants avec des molécules simples. Les expériences de Miller consistent dans la modélisation des conditions sur Terre avant l’apparition de la vie. Il n’y avait pas beaucoup d’oxygène en ce moment et l’atmosphère était essentiellement composée d’ammoniac, de méthane, d’hydrogène et d’eau. La température était bien plus élevée et il y avait beaucoup d’éclairs. Dans ces conditions, certaines molécules présentes dans les organismes vivants se sont formées spontanément: urée, glycine, alanine, …

Miller-Urey_experiment-en.svg

Pourtant, il n’y avait aucune trace de protéines et surtout d’ARN (acides ribonucléiques), les molécules capables d’écrire des molécules d’ADN (acides désoxyribonucléiques). Il a été montré plus tard que certaines molécules de météorites permettaient la formation d’ARN.

bioc6

Principales caractéristiques de la biochimie

Les limitations

Parmi les bonnes centaines d’atomes du tableau de Mendeleev, on ne trouve que 16 liaisons différentes en biochimie mais elle permet la formation d’une infinité de molécules organiques. Ceci est d’autant plus surprenant que les réactions impliquées dans les processus biologiques sont limitées par les conditions biologiques de l’existence: il n’y a aucune manière qu’une réaction qui nécessite une température de 100 ° C ait lieu dans notre corps. Cela endommagerait les molécules environnantes et brûlerait les tissus. Comme toute réaction chimique, ils doivent obéir aux règles de la thermodynamique et trouver l’énergie nécessaire pour faire la réaction ailleurs.

La spécialisation

Dans un corps, les réactions sont faites dans des cellules et peuvent également être compartimentées à l’intérieur de la cellule. Toutes les cellules ne peuvent pas faire toutes les réactions et certaines cellules sont spécialisées. La spécialisation est écrite dans l’information génétique et se traduit par la présence ou l’absence de certaines enzymes. De plus, dans une cellule, il n’y a pas le même type de réactions dans les mitochondries que dans le réticulum endoplasmique. C’est parce que les réactions sont régulées, positivement ou négativement, par des catalyseurs.

Les Enzymes

La température doit rester basse (~ 37 ° C) et ne peut pas beaucoup varier. ΔG = ΔH-TΔS doit être négatif et proche de zéro. La vitesse de réaction serait proche de zéro sans catalyseur.

Il y a un système de régulation dans les cellules: l’activité des catalyseurs dépend des besoins de la cellule. Si la cellule est pleine d’une espèce D, il n’est pas nécessaire d’en accumuler davantage alors que les ressources pourraient être utilisées dans un processus différent. La présence de l’espèce D influencera un catalyseur (souvent une enzyme) qui agit sur une réaction conduisant à la formation de D. La présence de D peut inhiber une enzyme responsable de la réaction ou activer une enzyme inhibant la réaction. Au contraire, l’absence de D peut également être détectée par cette enzyme ou par une autre pour favoriser la formation de D.

bioc1

La gestion de l’énergie est un problème global pour le corps: les processus ne peuvent pas consommer ou rejeter trop de chaleur à la fois. Il pourrait endommager les cellules environnantes et inhiber la plupart des enzymes: la température du corps est habituellement dans la gamme optimale d’efficacité pour les enzymes et s’il y a une variation de température, l’activité des enzymes diminue de manière significative.

biov2

La régulation

De plus, il y a des périodes durant lesquelles nous consommons moins d’énergie (quand nous dormons par exemple) et des périodes où le corps a besoin de plus de ressources (en faisant du sport, en période de stress, …). Ces périodes ne coïncident pas avec les périodes pendant lesquelles nous produisons l’énergie (quand nous mangeons). Il doit donc y avoir un moyen efficace de stocker l’énergie quand elle est produite et de la libérer en cas de besoin. Cela se fait par la formation d’ATP (adénosine triphosphate) à partir d’ADP (adénosine diphosphate). Cette réaction n’est possible que dans les mitochondries mais l’énergie est nécessaire partout. L’énergie doit donc également être transportée dans les différents compartiments des cellules et dans le corps.

Ce cours se concentrera sur ces problèmes à travers l’exemple de la dégradation du glucose. Avant cela, nous allons faire une introduction des principaux types de molécules que nous trouvons le corps.

Les molécules du corps :

Ce cours se concentrera sur ces problèmes à travers l’exemple de la dégradation du glucose. Avant cela, nous allons faire une introduction des principaux types de molécules que nous trouvons le corps.

L’ eau

Notre corps est composé à 60-70% d’eau. La plupart des réactions sont ainsi réalisées dans des conditions aqueuses et polaires. L’eau implique une organisation entre les molécules. Dans la glace, une molécule d’eau forme des liaisons 4H avec d’autres molécules H2O.

ice

À la température du corps, ce nombre chute à environ 3,4. Les liaisons H se rompent facilement et fréquemment: leur énergie est de ~ 4,5 kcal / mol (contre ~ 110 kcal / mol pour une liaison covalente) et leur durée de vie est d’environ 10-9s.

Les liaisons H lient les molécules d’eau ensemble mais aussi la molécule d’eau à tout atome électronégatif (par exemple R-OH, R-CO-R, R-COOH, R-NH2 …). Les groupes qui forment des liaisons H sont appelés groupes hydrophiles. Les groupes qui ne permettent pas la formation de telles liaisons sont appelés groupes hydrophobes (une chaîne aliphatique par exemple, un phényle …). Les premières sont solubles dans l’eau alors que les secondes ne le sont pas (elles forment deux phases séparées). Une molécule qui porte des groupes hydrophiles et hydrophobes est appelée amphipathique.

La transpiration est un moyen que le corps a trouvé pour réguler la température: l’énergie de vaporisation de l’eau est de 540cal / g d’eau. Pour compenser la hausse de température de 1 degré, 2 grammes d’eau sont évaporés.

Les lipides :

Les lipides sont un groupe de molécules naturelles composées habituellement d’une tête hydrophile et d’une ou plusieurs chaînes hydrophobes.

bioc4

La présence de la tête polaire ne signifie pas que la molécule entière est soluble dans l’eau. Les chaînes hydrophobes sont insolubles dans l’eau et s’agrègent ensemble pour minimiser la surface de contact avec les molécules d’eau. Les principales fonctions biologiques des lipides comprennent le stockage d’énergie, la signalisation et l’action en tant que composants structuraux des membranes cellulaires. Les membranes qu’elles forment peuvent être soit une mono-couche (séparant une phase aqueuse et une phase organique) soit une bi-couche (séparant généralement deux phases aqueuses).

bioc5

Les lipides sont triés en fonction de la capacité à former du savon. Pour ce faire, le lipide doit contenir un acide gras (une chaîne hydrophobe finissant par un groupe COOH hydrophile).

bioc7b

Leur nomenclature est terminée par ~ (an) oate. Par exemple, CH3(CH2)10COO est appelé dodécanoate. Certains lipides portent des noms provenant du végétal dont ils proviennent. Par exemple CH3(CH2)14COO est appelé palmitate car il provient de palmiers. S’il y a une double liaison dans la chaîne, sa position est indiquée au début du nom par un Δx où x est la position du premier carbone avec un C = C et le suffixe est maintenant ~ enoate. Par exemple, CH3(CH2)CH=CH(CH2)7COOCH3  est appelé A9-hexadécénoate.

La présence d’une double liaison durcit la structure du lipide. Un lipide sans C = C est dit saturé et toutes les liaisons peuvent tourner. Ces lipides sont très flexibles. D’autre part, les C = C fixent la conformation localement car la double liaison ne peut pas tourner. En conséquence, la cohésion entre les chaînes est plus complexe et le nombre d’interactions de van der Waals diminue (en d’autres termes, les chaînes ne peuvent pas s’imbiber aussi bien que les chaînes saturées). Un lipide à double liaison est appelé insaturé. S’il y a plusieurs C = C, on parle de polyinsaturés. Pour illustrer la différence que fait un C = C, le tableau suivant montre une série de lipides avec leur température de fusion.

bioc8

Les lipides insaturés se trouvent sous la forme d’une huile tandis que les lipides saturés se présentent sous la forme de graisses. Il est possible d’hydrogéner les lipides insaturés pour éliminer le C = C.

Lipides saponifiables

Le glycérol est un polyalcool avec 3 groupes -OH sur une chaîne à 3 carbones. Quand il réagit avec 3 équivalents de RCOO- (un lipide), il forme un triacylglycérol. Le carbone noté * C est chiral si R1 et R2 sont différents. La réaction dans la direction opposée est la réaction de saponification:

bioc9

La réaction dans la direction opposée est la réaction de saponification:

bioc10

RCOONa est un savon. Le principe est assez simple: le savon forme des micelles autour de la saleté qui n’est pas soluble dans l’eau. Les chaînes hydrophobes encerclent la saleté et les têtes hydrophiles sont en contact avec l’eau.

bioc11

The whole thing is soluble in the water. Lipids are an energetic reservoir stocked under the form of pellets of fat in cells called adipocytes.

Waxes are a combination of a fatty acid with a fatty alcohol.

bioc12

Ils sont très hydrophobes et constituent une protection efficace contre l’humidité (exemple: la laine de mouton) ou pour empêcher l’eau de s’évaporer (ex: plantes tropicales, cactus). Les baleines à dents utilisent un mélange de cires et de triacylglycérol, appelé spermaceti pour nager sans effort dans les profondeurs. A 37 ° C, le mélange est une huile mais la température baisse et le mélange cristallise. Sa densité augmente, ce qui permet au cachalot de flotter à cette profondeur.

Les lipides polaires présentent souvent un phosphate ou une amine chargée

bioc13

Il y a beaucoup de dérivés de l’acide phosphatidique. Notons l’acide phosphatidique R,

bioc14

Beaucoup d’entre eux constituent les membranes de la cellule. Les sucres peuvent également être liées aux lipides par liaison ester et servir, dans ce cas, d’élément de signalisation.

Les sphingolipides sont des dérivés de la sphingosine et de la dihydrosphingosine.

bioc15

Les lipides sont liés par une liaison amide.

bioc16

Les éléments donnant des propriétés différentes à la molécule peuvent se lier à l’alcool. Par exemple, une choline peut se lier à l’aide d’une liaison phosphodiester.

bioc17

Cette molécule est une sphingomyéline et se trouve dans la membrane qui entoure certains axones des cellules nerveuses. Sur l’ester, un ucre peut être lié. Ces molécules sont appelées glycosphingolipides neutres ou cérébrosides parce qu’elles se trouvent souvent dans les membranes du cerveau. Encore une fois, le sucre est un élément de reconnaissance / signalisation.

Le sucre peut aussi être acide (par exemple un acide sialique) et alors la molécule est un glycosphingolipide acide, servant habituellement de récepteur.

Lipides non saponifiables

Terpènes

Ce sont de petites molécules dérivant de l’isoprène.

bioc18

Les plus petits terpènes sont les monoterpènes, résultant de la combinaison de deux isoprènes.

8 équivalents de l’isoprène forment le bêta-carothène. Cette molécule de 40 carbones est un antioxydant qui protège des radicaux libres: elle est facilement excitée car les électrons peuvent être délocalisés.

bioc19

C’est aussi un précurseur de la vitamine A. C’est un groupe de composés organiques nutritionnels insaturés (trouvés dans les carottes, entre autres) qui comprend le rétinol, le rétinal, l’acide rétinoïque et plusieurs caroténoïdes de provitamine A (notamment le bêta-carotène).

bioc20

La vitamine A a de multiples fonctions: elle est importante pour la croissance et le développement, pour le maintien du système immunitaire et pour une bonne vision. La rétine de l’œil a besoin de vitamine A sous forme de rétinal, qui se combine avec la protéine opsine pour former la rhodopsine, la molécule absorbant la lumière nécessaire à la fois à la vision faible (vision scotopique) et à la vision des couleurs.

Il y a deux types de capteurs dans l’œil: les cônes et les bâtonnets. Le premier détecte les couleurs et les secondes la lumière. Les bâtonnets sont composées d’une série de disques bilipidiques avec des récepteurs de rhodopsine. Entre les hélices d’opsin est le 11-cis-rétinal

bioc21

Toutes les liaisons sauf une dans la rétinal sont trans. Quand un photon frappe le rétinal, cette liaison devient trans, perturbant la molécule, puis les hélices protéiques qui transfèrent le signal nerveux. Un photon est suffisant pour générer un signal.

Dans les cônes, il y a des modifications spécifiques dans la structure de la protéine et le photon doit être dans une plage spécifique de longueur d’onde (c’est-à-dire une couleur) pour transférer le signal.

Les stéroïdes :

La base des stéroïdes est le stérol, une molécule faite de trois cycles de 6 C et un de 5 C.

bioc22

Le cholestérol est complètement hydrophobe. C’est un précurseur de plusieurs hormones, de la vitamine D et du sel biliaire.

bioc23

On entend souvent parler du bon et du mauvais cholestérol. C’est en fait une locution incorrecte. Le mode de transport du cholestérol est en fait le principe important. Le cholestérol est transporté par les lipoprotéines (une combinaison de lipides et de protéines) appelées LDL et HDL (pour les lipoprotéines de basse et haute densité). Le LDL transporte le cholestérol  du foie vers le corps. Il est lié à certains récepteurs spécifiques sur LDL. Le rôle du HDL est de ramener le cholestérol inutilisé au foie où il est détruit. Il y a donc un équilibre entre le cholestérol qui quitte le foie et qui revient au foie.

Les prostaglandines :

Ce sont des hormones agissant sur une courte distance, avec une durée de vie courte et elles sont toutes fabriquées à partir de l’arachidonate, un lipide de la membrane cellulaire, par une phospholipase. Les prostaglandines activent de nombreux récepteurs membranaires.

bioc24

A la suite d’un stimulus donné, certains agents sont activés pour activer la PLA2 (phospholipase A2)PLA2. La PLA2 clive les phospholipides de la membrane pour obtenir des acides gras. A partir d’un acide gras 4 types de prostaglandines sont formés:

1) prostacycline: ils se trouvent dans la paroi des vaisseaux sanguins et empêchent la coagulation.
2) PGE et PGF (Prostaglandines E et F): elles sont responsables du cycle du sommeil et des contractions à l’accouchement.

bioc25

  • thromboxane: ils sont impliqués dans le processus de coagulation.

bioc26

  • leucotriènes: nous les trouvons dans la paroi des poumons. Les asthmatiques ont une surproduction de leucotriènes.

L’aspirine bloque l’activité/production de la cyclo-oxygénase qui est une enzyme responsable de la formation des quatre types de prostaglandines à partir de l’arachidonate. La cortisone bloque la PLA2.

bioc28

Fonction principale des lipides: constituant des membranes

Les membranes des cellules séparent l’intérieur de l’extérieur des cellules. Les deux côtés sont aqueux mais l’intérieur de la membrane est hydrophobe. Les membranes bilipidiques se forment spontanément (appelées liposomes). Les membranes sont composées de lipides et de protéines dont la composition dépend de la cellule: essentiellement, les protéines permettent les échanges et les transports d’un côté de la membrane à l’autre tandis que les lipides sont la paroi en béton de la membrane. Le cholestérol se place dans la partie hydrophobe de la membrane pour la consolider.

Chapitre 1: calcul différentiel et intégral

Calcul différentiel et intégral

  a)      Définition de la différentielle

Soit une fonction y = f(x) admettant une dérivée finie y’ = f’(x) ,donnons à x un accroissement Δ x ,Par définition,le produit f’(x) Δ x  s’appelle la différentielle de f(x) On écrit :

df = f’(x) Δ x      ou     dy = y’ Δ x   

En particulier, si f(x) = x, on a f’(x) = 1  et dx = Δ x. Donc, dy s’écrit  dy = y’ dx ,d’ou  y’ = dy/dx  Exemple : y = x²     et y’ = 2 x

b)      Signification géométrique de la différentielle

Considérons la courbe d’équation y = f(x) et le point P( x ; y ) de cette courbe à l’accroissement Δ x correspondent deux points : l’un sur la courbe et l’autre sur la tangente en P  , y + Δ y est l’ordonnée du point sur la courbe y + dy est l’ordonnée du point sur la tangente. En effet, y’ étant le coefficient angulaire de cette tangente, y’ dx = dy

2) Notion d’intégrale

a)      Définition

On appelle primitive d’une fonction f(x), une fonction F(x) dont la dérivée est f(x) si F’(x) = f(x)

F(x) est une primitive de f(x)

Exemple : x² est une primitive de 2 x en effet, ( x² )’ = 2 x

b)      Propriété fondamentale

Si F(x) est une primitive de f(x) et C est une constante

a)        F(x) + C est aussi une primitive de f(x)

b)        toute primitive de f(x) est de la forme F(x) + C  

Exemple : une primitive de 2 x est x² + 5 ; x² – 273 ; … les primitives de 2 x sont x² + C c)

Notion d’intégrale indéfinie

f(x) étant une fonction continue, on représente l’ensemble des primitives de f(x) par ∫ f(x)dx ,qu’on appelle, intégrale indéfinie de f(x) 

Exemple : ∫2x dx = x² + C

3) Méthodes d’intégration

 Généralités: Intégrer une fonction, c’est rechercher son intégrale indéfinie c’est-à-dire l’ensemble de ses primitives

cristo 1     où C est une constante   Il n’existe pas de règles directes pour intégrer, comme il en existe pour dériver On recherche, selon certains procédés, la fonction dont la dérivée égale la fonction donnée

Remarque :   Cristo2   où C est une constante

Intégration immédiate  

Les formules de dérivation des fonctions simples donnent immédiatement :

Cristo3,

Cristo4

Cristo5

Cristo6

Cristo7

cristina1

Cristina2

Cristina3

Cristina4

Cristina5

Cristina6

 Intégration par décomposition

∫(C1U+C2V)dx =C1∫Udx +C2∫Vdx

C1 et C2 étant deux constantes et u et V des fonctions continues de X

Exemple

borzou e

4) Intégrale définie  

 Introduction  

Pour calculer l’aire d’une partie du plan, les mathématiciens grecs utilisèrent des méthodes géométriques qui consistaient à transformer la partie donnée du plan en un ou plusieurs polygones dont les aires sont plus faciles à calculer. Plus tard, c’est à l’aide de décomposition de parties du plan en parties élémentaires que KEPLER ( 1571 – 1630 ), entre autres, poursuivit ce calcul d’aires et de volumes. Grâce aux travaux d’autres mathématiciens, LEIBNIZ ( 1646 – 1716 ) et NEWTON ( 1643 – 1727 ) ont construit une méthode plus générale pour le calcul des aires et des volumes. Illustrons la décomposition en figures géométriques sur un exemple.

Soit une surface S limitée par trois droites a, b et c et une courbe G La fonction : f :  Y •  Y : x • x² de graphe cartésien G a  º x = 0 b  º x = 2 c º y = 0

images (10)

On découpe  respectivement en 2, 4, 8, 16, … 2 sous – intervalles de même longueur                               On construit des rectangles dont les bases sont les sous – intervalles et dont les hauteurs sont les réels déterminés de la manière suivante : 1er cas : l’image de l’origine du sous – intervalle 2ème cas : l’image de l’extrémité du sous – intervalle 3ème cas : l’image du milieu du sous – intervalle

         1er cas                                             2ème cas                                            3ème cas

Dans chacun des cas, on calcule la somme des aires des rectangles ainsi construits. Intuitivement, il est facile de comprendre que l’approximation de l’aire de la surface S s’améliore lorsque l’amplitude des sous – intervalles diminue, c’est-à-dire lorsque le nombre de subdivisions augmente. On obtient le tableau des résultats suivants où :

  • n est le nombre des sous – intervalles de
  • Si est la somme des aires des rectangles dans le 1er cas
  • Ss est la somme des aires des rectangles dans le 2ème  cas
  • Sm est la somme des aires des rectangles dans le 3ème  cas

 n  Si  Ss  Sm
 2  1  5  2,5
 4  1,75  3,75  2,625
 8  2,1875  2,921875  2,65625
 16  2,421875  2,921875  2,6640625
 32  2,54296175  2,79296875  2,666015625
 …  …  …
 32768  2,666544528  2,666788738  2,66666666

On voit que Si, Ss, Sm tendent vers le même réel 2,666… lorsque n tend vers +  ¥ Cette limite commune est l’aire S de la partie considérée au départ. On va montrer que ces trois suites des nombres ont la même limite lorsque n tend vers +  ¥  et que cette limite est On divise l’intervalle  en sous – intervalles successifs de même longueur h           Ainsi : Si = h . f(s0) + h . f(s1) + … + h . f(sn-1) = h . ( 0 h )² + h . ( 1 h )² + … + h . (  ( n – 1 ) h ) = h³ ( 1² + 2² + 3² + … + ( n – 1 )² )   Ss = h . ( 1 h )² + h . ( 2 h )² + … + h . ( n h )² = h³ ( 1² + 2² + 3² + … + n² )   Sm = h . f(m1) + h . f(m2) + … + h . f(mn-1) = h . (  ) + h . (  ) + … + h . (   ) =  ( 1² + 3² + 5² + … + ( 2 n – 1 )² ) Comme 1² + 2² + 3² + … + ( p – 1 )² + p² = il s’en suit que :

  • 1² + 2² + 3² + … + ( n – 2 )² + ( n – 1 )² =
  • 1² + 2² + 3² + … + ( n – 1 )² + n² =
  • 1² + 3² + 5² + … + ( 2 n – 1 )² = ( 1² + 2² + 3² + … + ( 2 n )² ) – ( 2² + 4² + 6² + … + ( 2 n )² )

= ( 1² + 2² + 3² + … + ( 2 n )² ) – 4 ( 1² + 2² + 3² + … + n² ) =    –  4 . =    ( 4 n + 1 – 2 ( n + 1 ) ) =   Il vient : Si =  h³    =   . Ss =  h³    =   . Sm = h³    =   . car h = Dès lors :   Si =   .     =    . 2 = Ss =   .    =   . 2  =   Sm =  .      =    .  4  =             b)      Intégrale définie d’une fonction continue   1)      Subdivision finie d’un segment   On divise le segment  en n intervalles successifs notés [ xi , xi+1 ] où 0  <  i   <  n – 1 x0 = a      et      xn = b             La suite de réels ( x0 , x1 , x2 , … , xi , xn-1 , xn ) est appelée une subdivision finie de     2)      Définition   Soit f :  Y •  Y : x • f(x) une fonction continue sur Soit une subdivision finie de  telle que tous les sous – intervalles ont la même longueur  Dx = On pose : =  ( x1 – x0 ) f(c1) + ( x2 – x1 ) f(c2) + … + ( xn – xn-1 ) f(cn) où f(ci) est la plus grande valeur prise par f sur [ xi , xi+1 ]   Fn = ( x1 – x0 ) f(d1) + ( x2 – x1 ) f(d2) + … + ( xn – xn-1 ) f(dn) où f(dc) est la plus petite valeur prise par f sur [ xi , xi+1 ]   = Fn =   Si la différence  – Fn tend vers o, lorsqu’on tend vers  + ¥, alors  et Fn admettent la même limite, lorsque n tend vers + ¥ On dit alors que f est intégrable Dans ce cas, toute somme  (αi) Dx, où αi est un réel quelconque de [ xi-1 , xi ], admet la même limite que  et Fn lorsque n tend vers + ¥                       Donc

Si           fi) Dx existe et est   indépendante des réels αi

alors :

  •   F est intégrable sur
  •   Cette limite est appelée l’intégrale définie de la fonction   f de x = a  à  x = b et est notée  ( x ) dx
  •   a et b sont appelés les bornes de  (   x ) dx

3)      Interprétation géométrique Soit f :  Y •  Y : x • f(x)     continue sur P, la partie du plan métrique rapporté à une base orthonormée qui est délimitée par : – l’axe des abscisses – le graphe cartésien de f – les droites d’équations  x = a   et   x = b   1er cas : f est positive sur

x

y

0

i) . Dx  > 0   D’où (x) dx  > 0           Ainsi, l’aire de la partie P = (x) dx         2ème cas : f est négative sur

x

y

0

i) .  Dx   < 0   D’où (x) dx   < 0         Ainsi, l’aire de la partie P = – (x) dx   3ème cas : f est quelconque sur Soit c un réel de  tel que f soit :

x

y

0

– positive sur a , c   – négative sur c , b Dans ce cas, l’aire de la partie P = (x) dx + ( – (x) dx )                       4)      Propriétés   Les théorèmes suivants conduisent au calcul de l’intégrale définie d’une fonction continue Théorème 1 :

Toute fonction   continue sur  est intégrable sur     On admet cet énoncé sans démonstration Dans la suite, on suppose que les fonctions sont continues sur   Théorème 2

La permutation des   bornes de l’intégrale définie d’une fonction continue change le signe de   cette intégrale

(x) dx   =   – (x) dx

    Démonstration Si l’on change les bornes de l’intégrale, on change le sens de parcours de l’intervalle Les facteurs  Dx changent de signe, tandis que les facteurs f(αi) conservent leur signe La somme (αi) .  Dxi change donc de signe et sa limite aussi   Conséquence immédiate             Théorème 3  

(x) dx = 0          Théorème 4 : additivité de l’intégrale définie  

 » c  Î  : (x) dx = (x) dx     +      (x) dx     On admet sans démonstration   Théorème 5 : linéarité de l’intégrale définie  

 

      = (x) dx + (x) dx             Démonstration =    ( f(αi) + g(αi) ) .  Dx =     ( f(αi) . Dx + g(αi) .  Dx ) =   f(αi) . Dx  +      g(αi) . Dx = (x) dx + (x) dx   Théorème 6

 » k  Π Y :  . f(x) dx = k . (x) dx     Démonstration f(x) dx =  k . ) . Dx = k .    ) . Dx   = k . (x) dx   Théorème 7 : théorème de la moyenne

Si :

  • m est la plus petite valeur prise par f sur
  • M est la plus grande valeur prise sur

alors 1)        m . ( b – a )  < (x) dx  < M ( b – a ) 2)        $ c  Î  : (x) dx = f(c) . ( b – a )     Démonstration 1)      Conséquence immédiate de la définition 2)      Puisque m ( b – a )   <  (x) dx  <  M ( b – a ) $ r  Π Y : (x) dx = r ( b – a ) , avec m  < r  < M Comme f (  ) =  et que f est continue sur On a : m  < r  < M   Þ  $ c  Î  : f(c) = r Dès lors, $ c  Î  : (x) dx = f(c) . ( b – a ) Théorème 8

Si f est une fonction continue sur alors : 1)        la fonction F :  Y •  Y :   x • (t) dt est dérivable sur 2)        la dérivée de F est f     Démonstration Soit x0  Î Par définition de F :  » x  Π \ {x0} :  = =                     par th2 =                                        par th4 =                                 par th7 avec r compris entre x et x0 = f(r)   Dès lors :  » x0  Î  : F’(x0) = =  f(r) = f(r) = f(x0)   Ainsi, si F est dérivable sur  et  » x Î  : F’(x) = f(x) Cqfd   Théorème 9 : théorème des fonctions admettant la même dérivée

Si :

  • F et G sont deux fonctions continues        sur
  • x         Î ] a , b [ : F’(x) = G’(x)

Alors F – G est une   fonction constante sur     Démonstration

  • Puisque F et G sont des fonctions dérivables sur ] a , b [  ,      la fonction F – G est aussi dérivable sur ] a , b [

F – G est, dès lors, continue sur ] a , b [

  • De plus,  » x  Î  : F’(x) – G’(x) = 0

C’est-à-dire   ‘ = 0 Donc  » x  Î  : F(x) – G(x) est une constante   Théorème 10 : formule de l’intégrale définie d’une fonction continue

Si :

  • f est continue sur
  • f est la dérivée de la fonction F, sur

alors  » x  Î    : (t) dt = F(x) – F(a) En   particulier : (t) dt = F(x) – F(a) =        Démonstration Considérons la fonction G :  •  Y : x • (t) dt Par le théorème 8, f est la dérivée de G Puisque F et g ont f comme dérivée sur  : $ k Î Y ,  » x Î  : G(x) – F(x) = k                         par th9 c’est-à-dire $ k Î Y ,  » x Î : (t) dt = F(x) + k En particulier, pour x = a, on a : F(a) + k = G(a) = (t) dt = 0 c’est-à-dire k = – F(a) Dès lors,  » x Î  : (t) dt = G(x) = F(x) – F(a) En particulier, si x = b, alors (t) dt = F(b) – F(a)

Chapitre 2 : Génie génétique

Définition Modification directe et dirigée du génome d’un organisme : bio-ingénierie. Biotechnologie: utilisation des voies biochimiques et métaboliques d’un organisme pour la production industrielle. Par exemple, les diabétiques doivent prendre de l’insuline et au début, cette insuline a été produite à partir d’insuline de porc, mais cette dernière a du par la suite être modifiée pour être mieux tolérée par les patients.

Procédés de Bio-ingénierie

Hybridation Des outils génétiques Analyse de l’ADN (électrophorèse et PCR) Technologie de l’ADN recombinant Thérapie génique Analyse du génome (empreintes digitales et puces à ADN)

OUTILS GENETIQUES

Enzymes pour la découpe, le collage, l’inversion des acides nucléiques. Permet à l’analyse de l’ADN, en utilisant les enzymes comme des outils: 1) ADN hélicase 2) Ligase : joints scellent deux morceaux d’ADN ensemble comme une colle moléculaire. 3) Polymerase : Lit un brin d’ADN et synthétise un brin complémentaire. Les ADN polymérases lient et répliquent des brins d’ADN. Les ARN polymérases peuvent à partir de brins d’ADN synthétiser des brins d’ARN. 4) La transcriptase inverse (fait des copies d’ADN à partir d’ARN) : crée une copie d’ADN à partir d’un brin d’ARN. C’est une propriété très inhabituelle et c’est la raison pour laquelle il est appelé transcriptase inverse. (puisque la transcription aboutit normalement à la formation d’ARN à partir d’ADN). Cette enzyme ne se trouve pas dans toutes les cellules; il se trouve que dans un couple de virus. Seule une petite une famille de virus VIH possède cette enzyme. 5) Les endonucléases de restriction reconnaissent des séquences d’ADN spécifiques et les découpent 6) Hélicase: déroule l’ADN double brin et vous pouvez le faire dans le tube à essai et l’autre possibilité est la chaleur qui dénature également l’ADN double brin;   Imaginez une séquence d’ADN, et nous découpons cette dernière  avec trois endonucléases de restriction différentes. Nous aurons ainsi des fragments. sans-titre (18)imagesCAVM4H6K (2)

Si nous avons deux enzymes avec 2 sites de coupure, nous obtiendrons trois fragments. Après cela nous pouvons les mettre sur un gel d’électrophorèse, procédé qui permet de séparer des fragments d’ADN en fonction de leur taille: Comment ça marche? Nous prenons un gel et nous mettons nos échantillons en haut de gel, puis nous l’exposons à une charge (normalement ADN a une charge négative, car il a de nombreux groupes de phosphate). Ainsi l’ADN commence à se déplacer vers le charge positive. La rapidité du déplacement dépend de la taille des fragments. Les grands fragments se déplacent plus lentement que les petits fragments; de sorte qu’il sépare les fragments d’ADN en fonction de leur taille. Nous allons voir un exemple avec une séquence d’ADN. Vous prenez un morceau d’ADN et nous souhaitons vérifier la séquence pour voir si elle correspond au gène vous pensez que c’est… Où est la séquence d’ADN que vous attendez? 5 ‘AAGCTAAGGATTCGTAT 3′ 3 ‘TTCGATTCCTAAGCATA 5′ Et vous pensez savoir où est cet ADN mais vous voulez vous assurer que c’est le gène correspondant. Ce que vous pouvez faire est de vous couper cet ADN par des endonucléases de restriction et vous savez que l’enzyme 1 coupe après la séquence AGCT. Et l’ enzyme 2 coupe après la séquence AGGA. Si vous ajoutez ces deux endonucléases de restriction différentes pour cet ADN vous pouvez prévoir combien de fragments vous allez trouver: 5 ‘AAGCTAAGGATTCGTAT 3′ 3 ‘TTCGATTCCTAAGCATA 5′ Nous devons trouver trois fragments après la procédure (après digestion complète), mais vous pouvez également connaître la taille de chacun de ces fragments. Vous savez que ce premier fragment doit être seulement trois nucléotides de long et le second fragment devrait être cinq nucléotides de long et le troisième fragment doit être neuf nucléotides de long. Maintenant, comment nous pouvons voir la taille des fragments? Vous allez l’exécuter sur gel d’électrophorèse.  Maintenant, vous mettez votre échantillon sur la surface du gel (après digestion), vous devez ajouter un mélange standard de chaque côte. Ensuite, vous exposez 1+1 à une charge. En combien de temps se déplace chaque fragment d’ADN dépend de sa taille, des fragments plus petits se déplacent plus vite, les fragments plus gros se déplacent plus lentement. Ainsi vous obtenez le mélange standard où vous avez un nucléotide, 2 fragments de nucléotides. Dans notre expérience, nous nous attendons à 3 fragments en position 3-5-9. sans-titre-8

Donc, des endonucléases de restriction peuvent être utilisés comme un moyen de vérification d’une séquence. Si vous avez un morceau d’ADN et vous n’êtes pas à 100 % sûr que vous voulez juste faire une double vérification avant de faire une autre manipulation.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

PCR amplifie l’ADN: il est comme une machine de copie de l’ADN PCR polymérise des copies d’ADN par une réaction en chaîne, ce qui est important parce que souvent vous pouvez avoir un échantillon d’ADN, mais vous n’en avez pas assez pour pouvoir l’analyser.

Juste parler, nous allons faire une électrophorèse sur gel ……… Nous aurons besoin d’une quantité considérable d’ADN pour exécuter ces différents tests. Très souvent, le problème est simplement que nous n’avons pas suffisamment d’ADN. Ainsi, la réaction en chaîne de la polymérase qui est une machine de copie peut nous aider à produire assez d’ADN dont nous avons besoin. Nous pouvons obtenir des millions de fragments en 4-6 heures Comment ça marche? Ici, nous avons un tube de PCR. Maintenant, si nous voulons une copie d’un morceau d’ADN Voyons voir ce genre de choses, nous devons lancer le tube de réaction. Les composants nécessaires sont : -une séquence d’ADN – un ADN-polymérase – des amorces – mélange nucléotidique Et puis nous ajoutons notre tube de PCR à une machine PCR

images (8)

Et la machine de PCR modifie la température afin de pouvoir copier l’ADN. Ici, nous avons notre modèle, une machine PCR qui monte jusqu’à 94 ° (ce qui est assez élevé pour dénaturer l’ADN et les deux brins se séparent). Puis l’appareil passe à 55 ° (température à laquelle les amorces peuvent se fixer), la machine passe ensuite à 72 ° (à cette température l’ ADN polymérase attache les amorces et commence à les copier pour obtenir en bout du compte deux exemplaires. Puis la machine remonte à 94 ° (…. «  » «  » «  » 55 ° (….. «  » «  » «  » 72 ° (…. Et ……..le processus se répète encore et encore de façon à obtenir une quantité d’ADN supérieure grâce à……. température.

imagesCALOUS1Cimages (9)

Avant l’apparition du de PCR on passait par les incubateurs (un à 94 °, un à 55 ° et un 72 °).

Récapitulatif des méthodes d’analyse de l’ADN

1) Les enzymes peuvent être utilisés comme des outils moléculaires 2) Le gel d’électrophorèse: sépare les fragments d’ADN selon leur taille 3) la réaction de polymérisation en chaîne: – Amplificateurs ADN (faire des copies de l’ADN) – Une bonne conception d’amorces permet l’isolement et l’amplification d’un gène particulier sur l’ensemble du génome En utilisant le PCR pour isoler et amplifier un gène du génome –  Les amorces sont conçues pour se lier un lieu précis en fonction de règles de complémentarité des bases d’ADN – Comme l’ADN polymérase III ne peut démarrer la réplication de l’ADN où l’amorce est fixée le site de fixation de l’amorce contrôle que l’ADN est répliqué par le PCR. – En concevant des amorces complémentaires sur chaque côté du gène d’intérêt, vous pouvez spécifier la PCR pour isoler et amplifier juste ce gène et rien d’autre 1) Isoler et amplifier une séquence spécifique à partir d’un morceau d’ADN 2) ici est un morceau d’ADN du génome humain

Le clonage

I Définition

Clonage : Transfert transitoire ou stable d’un ADN étranger dans une cellule procaryote ou eucaryote

Utilisation de vecteurs : plasmides, bactériophages, virus, cosmides …

II Applications

1)Biotechnologies

Pour la production de protéines eucaryotes par des micro-organismes recombinants tels que les hormones (insuline), vaccins ou anticorps.

2)Thérapie génique

Transfert d’un gène chez l’Homme pour prévenir l’apparition ou ralentir une maladie

3) Médecine légale

Empreinte digitale empreinte génomique

Clonage plasmidique

1) Les plasmides

Ce sont des petites molécules d’ADN bicaténaires, circulaires, extra chromosomiques qui ont la capacité de se répliquer de façon autonome.

Elles sont présentes naturellement dans le cytoplasme de nombreuses souches bactériennes. Ce qui génère d’ailleurs la résistance bactérienne aux antibiotiques.

Ces plasmides sont utilisés en génie génétique pour :

– le clonage et l’amplification d’une séquence d’ADN

– l’introduction d’un gène dans des bactéries (transformation), des cellules animales (transfection) ou des organismes entiers (animaux transgéniques).

– la production de protéines à l’échelle industrielle

Plasmide pBR322

pBR322 contient 4361 paires de bases et contient le réplicon du plasmide pMB1, le gène ampR, codant pour la protéine de résistance à l’ampicilline (source plasmide RSF2124) et le gène tetR, codant pour la protéine de résistance à la tetracycline. Le plasmide possède des sites de restriction uniques pour plus de quarante enzymes de restriction. 11 de ces 40 sites se trouvent dans le gène tetR. Il existe deux sites pour les enzymes de restriction HindIII et ClaI au sein du promoteur du gène tetR. Il ya six sites de restriction clés à l’intérieur du gène ampR. L’origine de réplication est un site ori.

pBR322

Plasmide pSecTag

pSecTag

L’insert

– T7 : fixe l’ARN polymérase

– ATG : codon initiateur (transcription)

– Igkappa leader : permet la sécrétion

– myc : détection de la protéine

– (His)6 : purification et détection

– TAA : terminaison de la transcription

Le plasmide

– PCMV : expression de la protéine

– BGH : facilite le séquençage

– f1 ori : réplication de l’ADN (bactéries)

– PSV40 : expression de la résistance zéocine

– Hygromycine : sélection (cellules mammifères)

– SV40 pA : terminaison de la transcription

– pUC : favorise réplication (bactéries)

– Ampicilline : sélection (bactéries)

 

Les enzymes de restrictions

Pour 1 digestion enzymatique : – H20 qsp 20 μl

– Tampon 10X (spécifique de chaque enzyme) : 2 μl

– BSA 0,2 μl

– ADN : 1 μl

– Enzyme : 1,5 μl    —> 1h  à 37°C

Migration sur gel d’agarose 0,5%

 

Chapitre 1: la technologie de l’ADN recombinant

Définition :

Les termes du génie génétique et l’ADN recombinant se réfèrent à des techniques dans lesquelles l’ADN peut être coupé, rejoint, sa séquence déterminée ou la séquence d’un segment modifié en fonction de l’utilisation prévue. Par exemple, un fragment d’ADN peut être isolé d’un organisme, joint à d’autres fragments d’ADN, et mis dans une bactérie ou d’autres organismes. Dans un autre exemple du génie génétique un fragment d’ADN, souvent un gène entier, peut être isolé et sa séquence nucléotidique déterminée ou sa séquence nucléotidique peut être altérée par des méthodes mutagènes in vitro. Ces activités connexes en génie génétique ont deux objectifs fondamentaux :
1) pour en apprendre davantage sur les œuvres de la nature.
2) trouver les moyens de faire usage de ces connaissances à des fins pratiques.
L’isolement du phage spécialisé de transduction qui portait les gènes de l’opéron lac a été une avancée particulièrement importante, car ces phages ont fourni un enrichissement de plus de 100 fois des gènes lac par rapport à l’ADN chromosomique. Il a également stimulé une grande variété d’études importantes qui ont favorisé grandement notre compréhension de la régulation des gènes ainsi que favorisé le développement de nombreuses techniques de génie génétique importantes. Maintenant le génie génétique permet les mêmes sortes d’études à effectuer sur un gène à partir de pratiquement tout organisme.

La deuxième raison majeure de l’intérêt du génie génétique est la synthèse économique de protéines, difficiles ou impossibles à purifier à partir de leurs sources naturelles. Ces protéines peuvent être des antigènes pour une utilisation dans l’immunisation, les enzymes pour une utilisation dans les procédés chimiques ou des protéines spécialisées à des fins thérapeutiques. Les séquences d’ADN cloné peuvent également être utilisées pour la détection des défauts chromosomiques et dans des études génétiques. Beaucoup de recherches en génie génétique ont également été réalisées dans les usines avec l’espoir d’améliorer les méthodes génétiques traditionnelles de modification des cultures. Un second objectif est l’introduction de la résistance aux herbicides dans les cultures souhaitées. Cela permettrait la pulvérisation contre les mauvaises herbes dans les champs même pendant la croissance au lieu de le faire avant la plantation. Le génie génétique de l’ADN implique généralement les étapes suivantes :
1) L’ADN pour l’étude doit être isolé et libéré des contaminants. Il doit être possible de couper cet ADN à des endroits spécifiques afin de produire des fragments contenant des gènes ou parties de gènes.
2) Ensuite il doit être possible de rejoindre les fragments d’ADN pour former des molécules d’ADN hybrides.
3) Les vecteurs doivent exister pour que les fragments assemblés puissent être introduits dans des cellules par le procédé appelé transformation.
4) Les vecteurs doivent avoir deux propriétés. Tout d’abord ils doivent fournir l’ADN autonome du vecteur pour la réplication dans les cellules et, d’autre part, ils doivent permettre une croissance sélective des seules cellules qui ont reçu les vecteurs.
Ce chapitre décrit les étapes fondamentales du génie génétique ainsi que la technique essentielle de la détermination de la séquence nucléotidique d’un fragment d’ADN

L’isolement de l’ADN :

L’ADN cellulaire, chromosomique ou non chromosomique, est le point de départ de nombreux expériences de génie génétique. Un tel ADN peut être extrait et purifié par les techniques classiques de chauffage des extraits cellulaires en présence de détergents et après élimination des protéines par extraction au phénol. Si des polysaccharides ou des ARN contaminent l’échantillon ils peuvent être éliminés par centrifugation à gradient de densité d’équilibre au chlorure de césium. Deux types de vecteurs sont communément utilisés : des plasmides et des phages. Un plasmide est un élément d’ADN semblable à un épisome qui se reproduit de manière indépendante du chromosome. Habituellement les plasmides sont de petites tailles, 3000 à 25.000 paires de bases et circulaire.

plasmide

En général, le phage lambda ou des dérivés apparentés sont utilisés comme vecteur pour des Escherichia coli, mais pour clonage dans d’autres bactéries, comme Bacillus subtilis, d’autres phages sont utilisés. Dans certains cas un plasmide peut être développé qui se réplique de façon autonome en dehors de plus d’un organisme hôte. Ces vecteurs « navettes » sont importants dans l’étude des gènes des eucaryotes, nous allons les examiner plus tard. Le plus souvent la purification complète de l’ADN de plasmide est inutile et l’ADN utilisable peut être obtenu simplement par la lyse des cellules en éliminant partiellement l’ADN chromosomique et la plupart des protéines. Les constructions complexes d’ADN nécessitent souvent l’ADN très pur pour éviter l’interférence des nucléases exogènes ou l’inhibition des enzymes sensibles.

L’isolement de l’ADN plasmidique :

La purification complète de l’ADN plasmidique nécessite généralement plusieurs étapes. Après que les cellules sont ouvertes avec le lysozyme qui digère la paroi cellulaire et que les détergents sont ajoutés pour solubiliser les membranes et  inactiver certaines protéines, la plupart des ADN chromosomiques sont éliminés par centrifugation. Pour de nombreux objectifs des méthodes chromatographiques peuvent être utilisées pour effectuer la purification. Lorsque la pureté la plus élevée est nécessaire le plasmide est purifié par la densité d’équilibre de centrifugation à gradient. Cela se fait en présence de bromure d’éthidium. Tout ADN chromosomique restant avec le plasmide aurait été fragmenté et sera linéaire, alors que la plupart des ADN plasmidique seront circulaires car liés de manière covalente. Comme nous l’avons vu précédemment  l’intercalation de bromure d’éthidium détord l’ADN.

DNA_intercalating_agent

Pour une molécule circulaire cette détorsion génère sur-enroulement alors que pour une molécule linéaire la détorsion n’a pas d’effets majeurs. Par conséquent un ADN linéaire peut intercaler plus du bromure d’éthidium qu’une molécule circulaire. Etant donné que le bromure d’éthidium est moins dense que l’ADN, les molécules d’ADN linéaires intercalées avec bromure d’éthidium « flottent » par rapport à l’ADN circulaire et donc les deux espèces peuvent facilement être séparées. Suivant la centrifugation, les deux bandes d’ADN sont observées par les UV éclairant la lumière du tube. La fluorescence naturelle du bromure d’éthidium est augmentée de 50 fois par intercalation dans l’ADN et le Phage lambda peut également être partiellement purifié par des techniques rapides et éliminer les débris cellulaires et la plupart des contaminants. Une purification plus complète peut être obtenue en utilisant leur densité unique de 1,5 g/cm3, qui est à mi-chemin entre la masse volumique de protéines, de 1,3 et la densité de l’ADN, 1.7. Le phage peut être isolé par la centrifugation à gradient de densité d’équilibre dans laquelle la densité à mi-chemin entre le haut et le bas du tube de centrifugation est de 1,5. Eux aussi peuvent être facilement observés dans la centrifugeuse. Ils forment une bande bleue qui résulte de la dispersion préférentielle des longueurs d’onde plus courtes de la lumière connue sous le nom d’effet Tyndall. Ce même phénomène est la raison pour laquelle le ciel est bleu et les couchers de soleil sont rouges.

La biologie des enzymes de restriction :

Dans cette section, nous allons d’abord voir la biologie des enzymes de restriction et puis revenir à leur utilisation pour couper l’ADN. On a maintenant trouvé un grand nombre d’enzymes qui coupent l’ADN à des endroits spécifiques. Pour la plupart ces enzymes proviennent de bactéries. Elles sont appelées des enzymes de restriction parce que, dans les quelques cas qui ont été soigneusement étudiés, le clivage enzymatique de l’ADN fait partie du système de restriction-modification de la cellule. Le phénomène de restriction-modification des bactéries est un système immunitaire à une petite échelle pour une protection contre l’infection par l’ADN étranger. Contrairement à des organismes supérieurs dans lesquels l’identification et l’inactivation de l’invasion des parasites, des bactéries ou des virus peuvent être effectuées de manière extracellulaire, les bactéries peuvent se protéger après que l’ADN étranger est entré dans leur cytoplasme. Pour cette protection de nombreuses bactéries marquent spécifiquement leur propre ADN par la méthylation des bases sur des séquences particulières avec des enzymes de modification. L’ADN qui est reconnu comme étranger par l’absence de groupes méthyle sur ces mêmes séquences est clivé par les enzymes de restriction puis dégradé par les exonucléases aux nucléotides. Moins d’un phage sur 10000 sont erronément méthylés et sont capables de croître et de lyser un E.coli protégé par certains systèmes de modification-restriction. En outre les bactéries se protègent de l’ADN végétal et animal. L’ADN de beaucoup d’ animaux et de végétaux est méthylé sur la cytosine dans les séquences CpG. Beaucoup de souches de bactéries contiennent également des enzymes qui clivent l’ADN lorsqu’il est méthylé sur des positions spécifiques.

Arber a étudié la restriction du phage lambda dans E. coli et a constaté que La souche E. coli C ne contenait pas de système de modification-restriction. Souche B a un système de modification-restriction, et pourtant un autre reconnaît et méthyle une séquence nucléotidique différente dans la souche K-12. Phage P1 possède un système de modification- restriction propre à elle même qui est superposable au système de restriction-modification de l’hôte dans lequel elle est un lysogène.
Soit la notation λ-C représente la croissance de phage lambda qui a été cultivé sur La souche E. coli C. L’infection des souches B, K-12, et C avec λ sur diverses souches va se faire à différentes vitesses :

La possession d’un système de modification-restriction introduit des complexités dans le processus de replication de l’ADN. Imaginez que le double brin d’ADN contient des groupes méthyle sur les deux brins de l’ADN au niveau d’une séquence de reconnaissance. la réplication de l’ADN crée un duplex dans lequel l’un des brins des duplexes fille dans un premier temps n’a pas été modifié .
Cet ADN demi-méthylé ne doit pas être reconnu comme un ADN étranger et clivé, mais doit être reconnu comme «soi» et méthylé.

SEMI METHYLATED DNA

Par conséquent, le système de restriction- modification fonctionne comme un micro-ordinateur, reconnaissant les trois états différents de la séquence de reconnaissance il réagit de trois  manières différentes :
1) Si la séquence n’ est pas méthylé, les enzymes la clivent.
2) Si l’ADN est méthylé sur l’un des deux brins, le système de modification méthyl l’autre brin.
3) si l’ADN est méthylé sur les deux brins, les enzymes ne font rien.
Une séquence de reconnaissance palindromique simplifie le fonctionnement du système de modification-restriction. Un palindrome est une séquence qui se lit de la meme manière de gauche à droite et de droite à gauche, comme les mots « REPAPER et RADAR ». Comme les brins d’ADN possèdent une direction, on considère une séquence d’ADN à palindrome si elle est identique à la lecture de 5 ‘à 3′ sur le brin supérieur et le brin inférieur . les Palindromes, peuvent être de toutes tailles, mais la plupart de ceux qui sont utilisés en tant que séquences de reconnaissance de modification-restriction sont quatre, cinq, six, et rarement, huit bases. En vertu des propriétés de palindromes, les deux filles de palindromes répliquées ont des séquences identiques, et donc l’enzyme de modification doit reconnaître et méthyler un seul type de substrat (Fig. 9.4).

 palindrome-sequences
Comme nous l’avons déjà vu précédemment pour la reconnaissance des séquences non palindromic, il faudrait que l’enzyme de modification reconnaîsse à la fois les deux séquences différentes. On peut supposer que les protéines dimères sont utilisés pour les reconnaître. Les enzymes de restriction sont divisés en trois catégories principales. les enzymes
1) Classe I : ces enzymes sont formées de 3 sous-unités (d’une sous-unité de clivage,une sous-unité de méthylation et une sous-unité de reconnaissance des séquences). Ces enzymes clivent à
des sites éloignés de leurs séquences de reconnaissance et ne seront pas discuté ici même si elles ont été les premiers à etre découvertes.
2) Classe II :les enzymes de classe II possèdent leur sous unité de reconnaissance des séquences et leur sous unités de clivage ensemble. Ils coupent près de leur séquence de reconnaissance et sont le plus utilisé dans le génie génétique.
3) classe III possèdent  3 sous-unités (la sous-unité de clivage associée à celle de reconnaissance et la sous-unité de  méthylation). Ces enzymes  coupent  près de leur site de reconnaissance.
Une enzyme de restriction dans une cellule est une bombe à retardement parce que les principes physicà-chimiques
limitent leur spécificité pour la liaison. Si une enzyme de restriction se liait à une séquence erronée, et comme une bactérie typique contient environ 4 × 1000000 de telles séquences, très probablement la séquence ne serait pas méthylé et l’enzyme pourrait cliver l’ADN et la cellule mourrerait. l’observation, cependant, est que les cellules contenant des enzymes de restriction ne meurent pas plus vite que les cellules sans enzymes de restriction. Comment, alors, est généré  la spécificité  extraordinairement grande  des enzymes de restriction ?

 La coupure d’ADN avec des enzymes de restriction :

Les enzymes de restriction fournissent un outil nécessaire pour couper des fragments de l’ADN  à partir de molécules plus grandes. Leur spécificité  permet une  très  grande sélectivité, et leur grand nombre ( plus d’une centaine de restrictions différentes), permet une trés grande  variétés  de choix des  sites de clivage utilisés. Souvent, les fragments peuvent être produits avec des points d’extrémité situés à moins de 20 paires de bases de n’importe quel emplacement souhaité.

Une des propriétés les plus utiles des enzymes de restriction pour le génie  génétique se trouve dans le système de modification-restriction produit par Plasmide R d’E.coli. L’enzyme de restriction correspondante est appelée Eco RI. Au lieu de cliver au centre de sa séquence de reconnaissance palindromique, cette enzyme coupe à l’extrémité et produit des extrémités à 4 bases complémentaires.Ces extrémités « collantes » sont les plus utiles dans la technologie de l’ADN  recombinant. Elles peuvent être re-soudés  à basse température comme les extrémités « collantes » du phage lambda. Cela permet l’assemblage efficace des fragments  de l’ADN au cours des étapes de soudures . Environ la moitié des enzymes de restriction, actuellement  connu peuvent générer des extrémités en surplomb ou collantes. Dans certaines situations, un fragment d’ADN peut même être agencé de telle manière à avoir deux types de collant différents.

L’isolement des fragments d’ADN :

Après le clivage de l’ADN par des enzymes de restriction ou d’autres manipulations (cf plus tard) les fragments d’ADN doivent souvent être isolés. Heureusement, le fractionnement en fonction de la taille est particulièrement facile parce que, comme indiqué précédemment, l’ADN possède un rapport charge sur masse  constant et les fragments d’ADN double brin de la même longueur ont la même forme et donc migrent  pendant l’électrophorèse à une vitesse pratiquement  indépendant de leur séquence. En général, plus l’ADN est grand,  plus sa vitesse de migration est lente.  Une très grande résolution peut être obtenue en électrophorèse par example deux fragments dont les tailles diffèrent de 0,5% peuvent être séparés si elles se trouvent dans une plage de 2 à 50 000 paires de bases. Une plage typique pour une séparation de taille adéquate pourrait être de 5 à 200 paires de bases ou 50 à 1000 paires de bases, et ainsi de suite. Le matériau à travers lequel l’ADN est soumis à une électrophorèse doit posséder des propriétés particulières. Il doit être peu coûteux, facilement utilisable, non chargée, et il devrait former un réseau poreux. Deux matériaux répondent aux exigences: agarose et polyacrylamide. Après l’électrophorèse, les bandes formées par les différentes tailles des fragments peuvent être localisés par autoradiographie si l’ADN avait été radiomarqué avant la séparation. Habituellement 32PO4 est une étiquette commode parce que le phosphate se trouve dans l’ARN et l’ADN, 32P émet notamment  des  électrons énergétiques qui les rend facilement détectables, et enfin 32P a une demi-vie courte de sorte que la plupart des atomes radioactifs dans un échantillon désintégreront  dans un délai raisonnable. L’isotope  33P  est également utilisé. Sa désintégration bêta est plus faible, et il a une demi-vie de 90 jours. Souvent, l’ADN est suffisamment présent et il peut être directement détecté par coloration avec éthidium bromure. La fluorescence accrue du bromure d’éthidium intercalées dans l’ADN par rapport à sa fluorescence dans la solution  permet la détection d’aussi peu que 5 ng d’ADN dans un groupe. Après la séparation par l’ électrophorèse et  la détection de l’ADN, les fragments souhaités peuvent être isolé à partir du gel.

Souder les fragments d’ADN :

Après la coupure et la purification de l’ADN nous allons discuter de l’assemblage des molécules d’ADN. In vivo, l’enzyme ADN ligase répare les entailles survenant sur la squelette de l’ADN. Cette activité peut également être utilisés in vitro pour la jonction de deux molécules d’ADN. Deux exigences doivent être respectées. D’abord, les molécules doivent être les substrats corrects, autrement dit, ils doivent posséder des groupes hydroxyle 3′- et 5′-phosphate. Ensuite les groupes sur les molécules à assembler doivent être correctement positionnés par rapport à l’autre. Le procédé pour produire le bon positionnement présente deux variantes: soit hybrider les fragments ensemble par leurs extrémités collantes complémentaires :

et, si  l’assamblage concerne des  fragments coupés avec bouts francs  , d’utiliser des concentrations  très élevées de fragments qui, de temps en temps,seront spontanément face à face avec positions correctes.De nombreuses enzymes de restriction telles que EcoRI produisent des extrémités collantes à quatre bases qui peuvent être soudées ensembles. Comme  les extrémités collantes sont généralement seulement quatre  paires de base, la baisse de la température  à environ 12 ° C, facilite le processus d’hybridation-ligature. Les extrémités franches de molécules d’ADN qui sont générés par certaines  enzymes de restriction génèrent des problèmes. Une solution consiste à convertir les bouts francs des molécules à des bouts collants par l’enzyme terminale transférase. Cette enzyme ajoute des nucléotides à l’extrémité 3′ de l’ADN. Une queue Poly-dG peut être ajouté à un fragment et une queue poly-dC peut être ajouté à l’autre et les fragments peuvent ensuite être hybridés ensemble

Si les queues sont assez longues, le complexe peut être introduit directement dans les cellules, où les lacunes et les pseudos seront remplis et scellés par le système enzymatique des cellules. Le plus souvent, la réaction en chaîne par polymerase ( PCR) serait utilisée pour générer des extrémités souhaitées sur les molécules. En outre les molécules ayant un bout franc peuvent également être soudées
par  l’ADN ligase. Bien que cette méthode est très simple, elle souffre de deux inconvénients: Elle nécessite des concentrations élevées d’ADN et de l’ADN ligase  pour que la réaction s’initie et meme dans ces conditions l’efficacité reste faible.  En outre, il est difficile d’exciser le fragment du vecteur . Les Lieurs peuvent également être utilisés pour générer des molécules  auto-complémentaires monocaténaires. Les Linkers sont des ADN  courtes avec bouts francs ,  contenant la séquence de reconnaissance d’une enzyme de restriction qui produit des extrémités cohésives. La ligature des lieurs à des fragments d’ADN se produit avec un rendement  assez haut car des concentrations molaires élevées des lieurs peuvent facilement être obtenues. Une fois que les lieurs ont été relié au segment d’ADN, le mélange est digéré avec l’enzyme de  restriction qui coupe les lieurs et génère des extrémités collantes.  Ainsi une molécule d’ADN à bout franc est converti en une molécule collante à composition non limitée qui peuvent facilement être jointes à d’autres molécules d’ADN.

Chapitre 1 : les cellules souches

C’est quoi une cellule souche ? 

Toutes les cellules dans le corps humain proviennent d’un œuf fécondé qui est formé par l’union de l’ovule et du spermatozoide. Mais le corps est constitué de plus de centaines de différents types de cellules. Tous ces types de cellules proviennent d’un pool de cellules souches dans l’embryon précoce. Au début du développement ainsi que tard dans la vie divers types de cellules souches donnent naissance à des cellules spécialisées ou différenciées qui réalisent les fonctions spécifiques de l’organisme telles que des cellules sanguines, musculaires, osseuses et nerveuses.

Les cellules souches peuvent produire d’autres cellules souches ou régénérer tous  types de cellules spécialisées. Cette propriété de la cellule souche la rend attrayante pour les scientifiques qui cherchent à créer des traitements médicaux qui remplacent les cellules perdues ou endommagées.

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Différents types de cellules souches :

Les cellules souches se trouvent en chacun de nous dès les premiers stades du développement humain jusqu’à la fin de la vie. Toutes les cellules souches peuvent se révéler utiles pour la recherche médicale mais chacun des différents types possède à la fois la promesse et les limites. Les cellules souches embryonnaires, qui peuvent être dérivées à partir d’un stade très précoce dans le développement humain, ont le potentiel de produire tous les types de cellules du corps. Les cellules souches adultes, qui se trouvent dans certains tissus chez les humains pleinement développés, des bébés aux adultes, peuvent être limitées à la production de certains types de cellules spécialisées. Récemment les scientifiques ont également identifié des cellules souches de sang de cordon ombilical et du placenta qui peuvent donner lieu à divers types de cellules sanguines.

Cellules souches embryonnaires :

Un blastocyste est un embryon de pré-implantation qui se développe 5 jours après la fécondation d’un ovule par un spermatozoïde. Il contient tout le matériel nécessaire pour le développement d’un être humain complet. Le blastocyste est une sphère presque totalement creuse. A l’intérieur du blastocyste se trouve la masse cellulaire interne qui est composée de 30-34 cellules qui sont désignées par les scientifiques comme pluripotentes car elles peuvent se différencier en tous types de cellules du corps.

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Durant le développement normal le blastocyste est implanté dans la paroi de l’utérus pour devenir l’embryon et continuer à se développer jusqu’à un organisme mature. Les cellules externes forment le placenta et la masse cellulaire interne se différencie en différents types de cellules spécialisées du corps.

Lorsque le blastocyste est utilisé pour la recherche sur les cellules souches les scientifiques prennent la masse cellulaire interne et les placent dans un milieu de culture  riche en nutriments où elles donnent naissance à des cellules souches embryonnaires. Les cellules souches embryonnaires semblent être plus flexibles que les cellules souches trouvées chez l’adulte parce qu’elles ont le potentiel de produire tous les types de cellules dans le corps humain. Elles sont aussi généralement plus faciles à recueillir, purifier et maintenir dans le laboratoire que les   cellules souches adultes. Les scientifiques peuvent induire les cellules souches embryonnaires à se répliquer dans un état indifférencié pendant de très longues périodes de temps avant de les stimuler pour créer des cellules spécialisées. Cela signifie que seulement quelques cellules souches embryonnaires peuvent construire une grande banque de cellules souches pour être utilisée dans des expériences. Cependant ces cellules souches indifférenciées ne peuvent pas être utilisées directement pour les greffes de tissus car elles peuvent provoquer un type de tumeur appelée tératome. Pour être utilisée en clinique les cellules souches embryonnaires devront d’abord être différenciées en cellules spécialisées.

Certains croient que la recherche sur les cellules souches embryonnaires est moralement répréhensible parce que quand les scientifiques suppriment la masse cellulaire interne, le blastocyste n’a plus le potentiel pour devenir un être humain pleinement développé.

Sources de cellules souches embryonnaires (Fécondation In Vitro) :

La plus grande source potentielle de blastocystes pour la recherche sur les cellules souches est la fécondation in vitro (FIV). La FIV nécessite l’extraction des ovules d’une femme par une intervention chirurgicale. Et cela  après que la femme a subi un traitement intensif par les « médicaments de fertilité» qui stimulent ses ovaires à produire plusieurs ovules matures. Lorsque la FIV est utilisée à des fins de reproduction les médecins fécondent généralement tous les ovules recueillis afin de maximiser leur chance de produire un blastocyste viable qui peut être implanté dans l’utérus. Comme  tous les œufs fécondés ne sont pas implantés il en résulte une grande banque de blastocystes excédentaires stockés dans des congélateurs à travers le pays. Les blastocystes stockés dans des cliniques de FIV  pourraient se révéler être une source importante de cellules souches embryonnaires pour une utilisation dans la recherche médicale. Cependant, parce que la plupart de ces blastocystes ont été créés avant l’avènement de la recherche sur les cellules souches, la plupart des donateurs n’ont pas donné leur permission pour utiliser ces blastocystes pour la recherche.

La fécondation in vitro (FIV) pourrait également être utilisée pour produire des blastocystes spécifiquement à des fins de recherche. Cela faciliterait l’isolement des cellules souches avec des traits génétiques spécifiques nécessaires pour l’étude de maladies particulières. Par exemple il peut être possible d’étudier les origines d’une maladie héréditaire comme la fibrose kystique à l’aide de cellules souches fabriquées à partir de donneurs d’ovules et de spermes qui ont cette maladie. La création de cellules souches spécifiquement pour la recherche en utilisant la FIV est, cependant, éthiquement problématique pour certaines personnes car il consiste à créer intentionnellement un blastocyste qui ne pourra jamais se développer en un être humain.

Transfert nucléaire :

Le processus appelé transfert nucléaire offre un autre moyen potentiel de produire des cellules souches embryonnaires. Chez l’animal le transfert nucléaire a été réalisé par l’insertion du noyau d’une cellule différentiée adulte, par exemple une cellule cutanée dans une cellule-oeuf dont le noyau a été enlevé. Cet oeuf, qui contient maintenant le matériel génétique de la cellule de la peau, est stimulé pour former un blastocyste à partir duquel les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues.

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Les cellules qui sont créées de cette manière sont, par conséquent, des copies ou des « clones » de la cellule d’origine de l’adulte car leur ADN nucléaire correspond à celui de la cellule adulte.

Depuis l’été 2006 le transfert nucléaire n’a pas été couronné de succès dans la production de cellules souches embryonnaires humaines mais les progrès dans la recherche suggèrent que les scientifiques pourraient être en mesure d’utiliser cette technique pour développer des cellules souches humaines à l’avenir.

Produire les cellules souches embryonnaires, par transfert de noyaux, n’est pas le même que le clonage reproductif.

L’utilisation du transfert nucléaire pour développer des cellules souches spécifiques de la maladie peut être appelé clonage de recherche et l’utilisation de cette technique pour les greffes de tissus personnalisées est parfois appelée clonage thérapeutique. Ces termes doivent être soigneusement distingués du clonage reproductif dont l’intention est d’implanter un embryon cloné dans l’utérus d’une femelle et de lui permettre de se développer pleinement dans un individu. Ce fut la technique par laquelle le brebis Dolly a été fait   et est maintenant largement utilisé pour le clonage reproductif chez les animaux. Chez l’homme, cependant, le clonage reproductif a été activement découragé par la plupart dans la communauté scientifique.

Les scientifiques croient que, s’ils arrivent à utiliser le transfert nucléaire pour obtenir des cellules souches humaines, ils pourraient étudier le développement et la progression de maladies spécifiques en créant des cellules souches contenant les gènes responsables de ces maladies. Dans l’avenir les scientifiques peuvent aussi être en mesure de créer des cellules souches «personnalisées» qui ne contiennent que de l’ADN d’un patient spécifique. Les cellules souches embryonnaires créées par transfert nucléaire seraient génétiquement appariées à une personne qui a besoin d’une greffe ce qui rend beaucoup moins probable que le corps du patient rejète les nouvelles cellules par rapport à ce qu’elles seraient avec les procédures traditionnelles de greffe de tissu.

Bien que l’utilisation du transfert nucléaire pour produire des cellules souches n’est pas le même que le clonage reproductif, certains sont préoccupés par d’éventuelles mauvaises applications de la technique à des fins de clonage reproductif. D’autres considérations éthiques comprennent le don d’ovules, ce qui exige le consentement éclairé et la destruction possible de blastocystes.

Cellules souches adultes :

Les cellules souches adultes sont cachées au plus profond au sein des organes, entourées par des millions de cellules ordinaires, et peuvent aider à reconstituer certaines des cellules de l’organisme en cas de besoin. En fait certaines cellules souches adultes sont actuellement utilisées dans les thérapies. Elles ont été trouvées dans plusieurs organes qui ont besoin d’un apport constant de cellules, tels que le sang, la peau et la doublure de l’intestin, et ont également été trouvées dans des endroits surprenants comme le cerveau qui est connu pour ne pas reconstituer facilement ses cellules. Contrairement aux cellules souches embryonnaires les cellules souches adultes sont déjà quelque peu spécialisées. Par exemple les cellules souches du sang normalement donnent naissance à de nombreux types de cellules sanguines et les cellules souches nerveuses ne peuvent faire que différents types de cellules du cerveau. Toutefois des recherches récentes suggèrent que certaines cellules souches adultes pourraient être plus souples qu’on ne le pensait et peuvent être faites pour produire une plus grande variété de types de cellules. Par exemple certaines expériences ont suggéré que les cellules souches du sang adulte isolées de souris peuvent également être en mesure de produire des cellules hépatiques, musculaires et cutanées mais ces résultats ne sont pas encore éprouvés et n’ont pas été démontrés avec les cellules humaines. Néanmoins les scientifiques travaillent sur la recherche d’un moyen de stimuler les cellules souches adultes ou même d’autres types de cellules adultes à être plus polyvalents. S’ils réussissent ils pourraient fournir une autre source de cellules souches non spécialisées.

Identifier les cellules souches :

Dès 1961 les scientifiques savaient que la moelle osseuse adulte contenait des cellules qui pourraient faire tous les types de cellules sanguines. Mais ce ne fut qu’en 1988 que ces cellules souches ont été isolées comme des populations pures. Pourquoi at-il fallu si longtemps ? Les techniques d’identification des cellules souches ont récemment été mises au point. Ceci est en partie parce que les cellules souches adultes sont, par leur nature même, peu visible dans la forme, la taille et la fonction. Elles ont aussi tendance à se cacher profondément dans les tissus et sont présentes seulement en un très petit nombre ce qui rend leur identification et l’isolement très difficile c’est comme trouver une aiguille dans une botte de foin.

Comment les scientifiques savent quand ils ont trouvé une cellule souche ? Chaque cellule affiche une matrice de protéines sur sa surface; différents types de cellules ont des protéines différentes. Les scientifiques peuvent utiliser ces protéines de surface comme des «marqueurs» qui caractérisent les types de cellules individuelles -un type de ID moléculaire. Par exemple, en utilisant des molécules qui reconnaissent et s’attachent à des protéines de surface spécifiques et qui sont rendues fluorescentes sous certaines longueurs d’onde de la lumière, les scientifiques peuvent visuellement faire la différence entre une cellule de sang. Malheureusement, les cellules souches ne peuvent pas encore être identifiées de cette manière parce que on n’a pas encore identifié des marqueurs pour tous les types de cellules souches. Des scientifiques identifient également les cellules souches en observant leur comportement dans le laboratoire : les cellules souches doivent être en mesure de rester non spécialisées et puissent s’auto-renouveler pour de longues périodes de temps.

Les scientifiques pensent qu’il pourraient y avoir plusieurs types de cellules souches adultes mais les trouver est un processus difficile.

La culture de lignées cellulaires et la stimulation des cellules souches à se différencier :

La culture cellulaire est un terme qui se réfère à la croissance et le maintien des cellules dans un environnement contrôlé à côté d’un organisme. Une culture de cellules souches réussie est celle qui maintient les cellules en bonne santé, dans un état non spécialisé  et en division continue. La mise en culture des cellules souches dans la première étape de l’établissement d’une lignée de cellules souches -une collection de multiplication de cellules génétiquement identiques. Les lignées cellulaires sont importantes parce qu’elles fournissent un approvisionnement à long terme de cellules se multipliant qui peuvent être partagées entre les scientifiques pour la recherche et la thérapie. on a décrit certaines difficultés pour le maintien de lignées cellulaires : « au fil du temps, toutes les lignées cellulaires … changement, généralement accumulent des mutations génétiques nuisibles. Il n’y a pas de raison que les lignées de cellules souches se comportent différemment. Alors il faut étudier les raisons, en utilisant les lignées existantes de cellules souches … ces préoccupations nécessitant une surveillance de ces cellules ont continué ainsi que le développement de nouvelles lignées de cellules souches à l’avenir « .

Une fois qu’ils ont mis en place une lignée de cellules souches stables les scientifiques commencent le processus de provoquer les cellules souches à se différencier en types de cellules spécialisées. L’environnement cellulaire dans lequel les cellules souches naturellement résident fournit aux scientifiques des indices sur la façon de les faire différencier dans une boîte de culture. Par exemple dans la moelle osseuse, où les cellules souches du sang résident, les cellules osseuses envoient des signaux physiques et chimiques qui indiquent aux cellules souches du sang  de se différencier. Les scientifiques commencent tout juste à comprendre ces signaux et à avoir les moyens développés pour imiter les processus naturels dans les cultures cellulaires. Habituellement la technologie consiste à ajouter certaines protéines de la culture cellulaire et, dans certains cas, l’introduction de gènes spécifiques dans des cellules souches.

Il est essentiel que les scientifiques soient sûrs que les cellules souches sont pleinement différenciées avant de pouvoir les utiliser pour des applications médicales. Si les cellules souches non différenciées complètement (telles que des cellules souches embryonnaires) sont implantées directement dans un organisme, elles peuvent causer un type de tumeur appelé tératome qui a été observé dans des expériences utilisant des souris. Les cellules souches adultes semi-spécialisées et des cellules différenciées dérivées de cellules souches embryonnaires ne sont pas susceptibles de provoquer des tératomes.

Alternatives à l’utilisation d’embryons dans la recherche sur les cellules souches :

Pour répondre aux préoccupations éthiques au sujet de la destruction de blastocystes, les scientifiques tentent de trouver de nouvelles façons d’obtenir des cellules souches qui se comportent comme des cellules souches embryonnaires mais qui ne nécessitent pas la destruction de blastocyste. Comme la science progresse les questions d’éthique entourant ces alternatives peuvent également survenir. Certaines solutions de rechange possibles incluent :

1) Les cellules recueillies à partir de la morula, le stade de développement avant le blastocyste. La morula, une boule solide d’environ 16-30 cellules, semble en mesure de maintenir la perte de quelques cellules sans dommage au développement de sorte que les cellules restantes peuvent continuer à se développer. L’extraction de cellules de la morula est déjà utilisé dans certaines cliniques pour le dépistage de troubles génétiques chez les embryons produits par fécondation in vitro. Des chercheurs ont récemment montré que des cellules isolées à partir d’une morula de la souris peuvent donner naissance à des cellules souches embryonnaires, tandis que les cellules restantes dans la morula se développent en une souris saine. Toutefois ce processus peut encore être moralement inacceptable pour certains en raison de la possibilité d’effets néfastes pour la morula et parce que les effets à long terme, de prélever des cellules de morula, ne sont pas encore connus.

2) La création de cellules souches embryonnaires à travers un processus appelé transfert nucléaire altéré (ANT). Dans cette variante de la technique de transfert nucléaire les scientifiques créent  un blastocyste dont le matériel génétique a été modifié de sorte que le développement et l’implantation dans l’utérus ne sont pas possibles. Il vise à créer des entités de l’embryon comme si ce ne sont pas vraiment des embryons mais qui peuvent être une source de cellules souches pluripotentes. ANT, jusqu’ici seulement testé avec blastocystes de souris, pourrait permettre la création de cellules souches embryonnaires sans détruire un blastocyste humain viable. Certains de ceux qui s’opposent à la recherche sur les cellules souches  embryonnaires soutiennent la recherche ANT parce que le blastocyste résultant ne pourrait jamais se développer en un être humain complet et ne pourrait donc pas avoir le statut moral de l’embryon humain. Toutefois cette procédure est inacceptable pour certains autres parce qu’ils croient que cela implique la création d’un blastocyste imparfait qui est conçu pour être détruit.

3) reprogrammer une cellule adulte pour agir comme une cellule souche embryonnaire : Pendant le développement les cellules deviennent de plus en plus spécialisées, elles perdent progressivement la capacité de tourner sur les gènes qui permettent aux cellules souches embryonnaires d’être tellement polyvalente. Le silence de ces gènes semble être responsable du maintien de cellules spécialisées, et de limiter les capacités de différenciation des cellules souches adultes. Par «reprogrammation» des cellules  adultes, afin qu’elles puissent se retourner sur les gènes qui permettent la polyvalence, les scientifiques espèrent les faire revenir à un état plus souple. Il est même possible que les scientifiques pourraient un jour « reprogrammer » toute cellule, non seulement des cellules souches. Cependant la recherche dans ce domaine est dans les premiers stades et les scientifiques peuvent être de nombreuses années loin de faire d’une cellule adulte aussi polyvalente qu’une cellule souche embryonnaire.

Chapitre 1 :Metabolisme cellulaire

Il existe différentes vois métaboliques :
– Le thermodynamisme
– L’énergie libre
Introduction aux enzymes
Vue d’ensemble: l’énergie de la vie
La cellule vivante est une usine chimique miniature où des milliers de réactions ont lieu. La cellule extrait de l’énergie et de l’énergie qu’elle va utiliser pour élaborer différentes réactions. Certains organisme convertissent même l’énergie en lumière: c’est la bioluminescence.
Organisation de la biochimie dans les voies métaboliques
Une voie métabolique commence par une molécule spécifique et se termine avec un produit. Chaque étape est catalysée par une enzyme. Certains voies métaboliques décomposent des molécules. Ces voies cataboliques libèrent de l’énergie en cassant les molécules complexes en des composés plus simples.
La respiration cellulaire, la dégradation du glucose en présence d’oxygène, est un exemple d’une voie de catabolisme. D’autres voies métaboliques créent des molécules. Ce sont les voies anaboliques qui consomment de l’énergie pour construire des molécules complexes. La synthèse des protéines à partir des acides aminés est un exemple d’anabolisme.

La bioénergétique est l’étude de la façon dont les organismes gèrent leurs ressources énergétiques. L’énergie est la capacité de provoquer un changement. L’énergie existe sous différentes formes dont certaines peuvent réaliser des travaux.
L’énergie cinétique est l’énergie associée au mouvement. La chaleur (énergie thermique) est l’énergie cinétique associée au mouvement aléatoire des atomes ou des molécules.
L’énergie potentielle est l’énergie que possède une matière en raison de son emplacement ou de sa structure. L’énergie chimique est l’énergie potentielle disponible et libérée lors d’une réaction chimique. L’énergie chimique peut être convertie d’une forme à une autre.

Les lois de la transformation de l’énergie

La thermodynamique est l’étude de la transformation. Un système d’énergie fermé, comme celui d’un liquide dans un thermos, est isolé de son environnement. Dans un système ouvert, de l’énergie et de la matière peuvent être transformées entre le système et son environnement. Les organismes sont des systèmes ouverts.

La première loi de la thermodynamique

Selon la première loi de la thermodynamique, l’énergie de l’univers est constante: l’énergie peut être transférée et transformée, mais elle ne peut être ni créée ni détruite. La première loi est aussi appelée le principe de conservation de l’énergie.

La deuxième loi de la thermodynamique

Lors de chaque transfert d’énergie ou de  transformation, une partie de l’énergie est inutilisable et est souvent perdue sous forme de chaleur. Selon la deuxième loi de la thermodynamique, chaque transfert d’énergie ou de transformation augmente l’entropie (désordre) de l’univers.

Les cellules vivantes convertissent inévitablement des formes structurées d’énergie en chaleur. Des process spontanés se produisent sans apport d’énergie, ils peuvent se produire rapidement ou lentement. Pour qu’un processus se produise sans apport d’énergie, il faut augmenter l’entropie de l’univers.

Ordre biologique et le désordre

Les cellules créent des structures ordonnées à partir de matériaux moins ordonnés. Les organismes remplacent aussi des formes ordonnées de la matière et de l’énergie avec des formes moins ordonnées. Les flux d’énergie pénètre dans un écosystème sous forme de lumière et sort sous la forme de chaleur. L’évolution augmente l’ordre dans les organismes au niveau local, mais augmente le désordre dans l’univers de sorte que la deuxième loi n’est pas violée.

Equilibre et  métabolisme

La réaction dans un système fermé peut atteindre l’équilibre et ne pas marcher. Les cellules ne sont pas en équilibre, ce sont des systèmes ouverts avec un flux constant de matière. Un trait caractéristique de la vie est que le métabolisme n’est jamais en équilibre. Une voie catabolique dans une cellule libère de l’énergie libre dans une série de réactions. La variation d’énergie libre de réaction indique si oui ou non la réaction se produit spontanément.

Les biologistes veulent savoir quelles réactions se produisent spontanément et lesquelles nécessitent de l’énergie. Pour ce faire, ils ont besoin de déterminer les changements d’énergie qui se produisent dans les réactions chimiques.

L’énergie libre d’un système vivant est l’énergie qui est disponible pour faire le travail lorsque la température et la pression sont uniformes comme dans une cellule vivante.

Variation d’énergie libre (ΔG)

La variation d’énergie libre (ΔG) au cours d’un processus est lié à la variation d’enthalpie ou de variation de l’énergie totale (ΔH), variation d’entropie (ΔS) et de la température en Kelvin (T):

   ΔG = ΔH – T ΔS

Seules les processus avec un Δg négatif sont spontanés. Les processus spontanés peuvent être exploitées pour effectuer un travail. Stabilité de l’énergie libre et de équilibre énergétique. L’énergie libre est une mesure de l’instabilité d’un système de sa tendance à passer à un état plus stable. Lors d’un changement spontané, l’énergie libre diminue et la stabilité d’un système augmente. L’équilibre est un état de stabilité maximale. Un processus est spontanée et ne peut effectuer un travail que lorsqu’il se déplace vers l’équilibre.

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