Introduction : Le transfert de Southern est l’une des techniques centrales en biologie moléculaire. D’abord mis au point par E M Southern (1975), le transfert de Southern a pour résultat le transfert de molécules d’ADN, habituellement des fragments de restriction, d’un gel d’électrophorèse à une feuille de nitrocellulose ou de nylon, de telle sorte que le motif de  la bande d’ADN présent dans le gel est reproduit sur la membrane. Au cours du transfert ou à la suite d’un traitement ultérieur, l’ADN devient immobilisé sur la membrane et peut être utilisé comme substrat pour l’analyse d’hybridation avec des sondes d’ADN ou d’ARN marquées ciblant spécifiquement des fragments de restriction individuels dans l’ADN transféré. Essentiellement, le transfert de Southern est donc une méthode de «détection d’un fragment de restriction spécifique sur fond de nombreux autres fragments de restriction».

L’ADN restreint pourrait être un plasmide ou un clone de bactériophage, le transfert de Southern étant utilisé pour confirmer l’identité d’un fragment cloné ou pour identifier un sous-fragment intéressant à partir de l’ADN cloné, ou il pourrait s’agir d’ADN génomique. Et dans ce cas, ça sera une préparation pour des techniques telles que l’analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction. Dans cet article, les principes généraux du transfert de Southern sont décrits, suivis d’un survol des méthodologies utilisées pour la préparation de l’ADN avant le transfert, le transfert lui-même et l’analyse d’hybridation. L’article se termine par une étude des applications et des limites du transfert de Southern. Le principe du transfert de Southern ,l’aptitude de la poudre ou des feuilles de nitrocellulose à se lier à l’ADN étaient connue depuis de nombreuses années et a été utilisée dans les années 1950 et 1960 dans divers types d’études d’hybridation d’acides nucléiques. Dans ces premières techniques, l’ADN immobilisé était non fractionné, consistant simplement en un ADN total lié à la poudre de nitrocellulose ou déposé sur une feuille de nitrocellulose. L’introduction au début des années 1970 de méthodes d’électrophorèse sur gel permettant de séparer les fragments de restriction de l’ADN en fonction de leur taille a conduit au développement de techniques de transfert en masse de fragments séparés du gel au support de nitrocellulose. La procédure décrite par Southern (1975), impliquant un transfert capillaire de l’ADN du gel vers une feuille de nitrocellulose placée au-dessus, était simple et efficace et bien qu’embellie au fil des ans, cette procédure originale diffère légèrement de la méthode de routine encore utilisée dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. La méthode originale pour le transfert de Southern est illustrée sur la figure.

Un  électrophorèse sur gel d’agarose contenant les fragments de la restriction fractionnées, est placé sur une mèche de papier filtre qui forme une connexion entre le gel et un réservoir de tampon à haute teneur en sel. 1 membrane est placée sur le dessus du gel et recouverte d’une tour de serviettes en papier qui sont maintenues en place avec un poids. L’action capillaire a pour effet de faire tremper le tampon dans la mèche, le gel et la membrane du papier filtre et dans les serviettes en papier. Lorsque le tampon traverse le gel, les fragments d’ADN sont transportés avec celui-ci dans la membrane, où ils sont liés à la nitrocellulose. Le transfert efficace de fragments jusqu’à 15 kb de longueur dure environ 18 h, ce qui équivaut à peu près à la «nuit». La seule complication de la technique est la possibilité que le tampon contourne le gel en trempant directement de la mèche vers les serviettes en papier, ce qui est peu probable si l’installation est soigneusement assemblée. Des modifications plus récentes apportées au transfert de Southern sont présentées sur le schémas ci-dessous:

1 membrane est placée sur le dessus du gel et recouverte d’une tour de serviettes en papier qui sont maintenues en place avec un poids. L’action capillaire entraîne le trempage (passage) du tampon à travers la mèche de papier filtre, le gel et la membrane et dans les serviettes en papier. Lorsque le tampon traverse le gel, les fragments d’ADN sont transportés avec celui-ci dans la membrane, où ils se lient à la nitrocellulose. Le transfert efficace de fragments d’une longueur maximale de 15 kb dure environ 18 h, ce qui équivaut à peu près à «une nuit».

La seule complication technique est la possibilité que le tampon contourne le gel en passant directement de la mèche au tour de serviettes en papier , ce qui est peu probable si le montage est soigneusement assemblé.  L’amélioration majeure a été l’introduction de membrane en nylon, qui présente trois avantages par rapport à la membrane en nitrocellulose :

Premièrement, les membranes de nylon sont moins fragiles que les feuilles de nitrocellulose, ces dernières tendent à se fissurer lorsqu’elles ne sont pas manipulées avec doigté  pendant le transfert de Southern et se désintègrent généralement si l’on tente d’effectuer plus de deux ou trois analyses d’hybridation avec la même feuille. Les membranes en nylon ne peuvent pas être endommagées par la manipulation et une seule membrane peut être réhybridé jusqu’à dix fois, cette limite étant due non à une rupture éventuelle de la membrane mais à la perte progressive de l’ADN transféré lors d’hybridations répétées.

Le second avantage des membranes de nylon est que, dans certaines conditions (une membrane chargée positivement et un tampon de transfert alcalin), l’ADN transféré se lie de manière covalente à la membrane pendant le processus de transfert. Ce n’est pas le cas avec une membrane de nitrocellulose, qui lie initialement l’ADN de manière semi-permanente, l’immobilisation se produisant seulement lorsque la membrane est cuite à 808C. Le transfert sur une membrane de nylon chargée positivement peut donc réduire la perte possible d’ADN qui pourrait se produire par lessivage à travers la membrane pendant le processus de transfert, il est également plus rapide, le temps de transfert étant réduit de 18 h à 2 h.

Enfin, les membranes de nylon lient efficacement les fragments d’ADN jusqu’à 50 pb de longueur, alors que les membranes de nitrocellulose ne sont efficaces qu’avec des molécules de plus de 500 pb. La nitrocellulose n’a cependant pas été complètement remplacée car elle présente un avantage significatif par rapport aux membranes de nylon: une quantité réduite d’hybridation de fond, en particulier avec des sondes qui ont été marquées avec des marqueurs non radioactifs.

D’autres modifications ont été apportées à la procédure originale de transfert de Southern pour accélérer et améliorer l’efficacité du transfert. Des modifications de l’architecture du système de transfert capillaire ont été proposées, mais  ces procédés alternatifs sont plus compliqués à mettre en place que le simple transfert vers le haut représenté sur la figure ci-dessus et aucun n’offre une amélioration majeure de la vitesse ou de l’efficacité. Des améliorations peuvent cependant être obtenues en utilisant une méthode de transfert non capillaire, telle qu’un électro-transfert, qui utilise une électrophorèse pour déplacer l’ADN du gel vers la membrane. Cette technique a été initialement développée pour le transfert de gels de polyacrylamide, dont les tailles de pores sont trop petites pour un transfert capillaire efficace de l’ADN, et a également été appliquée à des gels d’agarose .

L’électro-transfert est plus rapide que le transfert capillaire mais, doit être effectué avec précaution car des problèmes peuvent survenir avec la formation de bulles si le gel devient trop chaud pendant le transfert. Le Transfert sous vide est un choix plus populaire pour les gels d’agarose, une pression de vide étant utilisée pour entraîner le tampon à travers le gel et la membrane plus rapidement que par simple action capillaire, ce qui permet de réduire le temps de transfert à 30 minutes. On a également tenté de se dispenser entièrement du transfert de Southern et d’effectuer une analyse d’hybridation directement avec le gel d’électrophorèse, l’immobilisation de l’ADN étant obtenue en séchant le gel de sorte que l’ADN soit piégé dans la matrice de gel déshydratée ou lié à un support solide sur lequel le gel est placé avant le séchage. Ces techniques se sont avérées utiles pour certaines applications mais, souffrent de signaux de fond élevés après l’analyse d’hybridation.

Préparation de l’ADN avant le transfert de Southern :

Préparation de l’ ADN génomique :

Les techniques utilisées pour préparer l’ADN pour le transfert de Southern dépendent du type d’ADN étudié. Pour l’ADN génomique, l’objectif est d’obtenir des molécules qui ne sont pas devenues fragmentées de façon extensive par cisaillement aléatoire au cours du processus d’extraction, de sorte que des fragments de restriction spécifiques de 20 kb et plus puissent être obtenus. Les cellules doivent donc être brisées dans des conditions relativement douces. Pour les cellules de culture tissulaire et les échantillons sanguins, l’incubation dans un tampon contenant un détergent tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS) est généralement suffisante pour rompre les membranes cellulaires et libérer l’ADN de masse moléculaire élevée. Les bactéries, qui sont entourées par une paroi cellulaire, peuvent être cassées en douceur par traitement avec une combinaison de lysozyme et d’éthylène-diamine-tétra-acétate (EDTA).

Le lysozyme est une enzyme qui dégrade certains des composés polymères présents dans la paroi cellulaire bactérienne et l’EDTA chélate les ions magnésium qui sont requis pour l’intégrité de la structure polymère. L’addition subséquente d’un détergent provoque l’éclatement des cellules. Les cellules végétales sont généralement brisées par le broyage physique de tissus qui ont été congelés dans de l’azote liquide. Cela provoque une certaine fragmentation de l’ADN mais fournit un rendement beaucoup plus élevé. Après la rupture cellulaire, les procédures d’extraction de l’ADN génomique se poursuivent avec des étapes visant à éliminer les principaux produits biochimiques autres que l’ADN présent dans l’extrait initial. Une protéase telle que la protéinase K pourrait être incluse dans le tampon utilisé pour la rupture cellulaire, afin de commencer la dégradation des protéines dans l’extrait, mais la déprotéinisation est habituellement réalisée par extraction au phénol, addition de phénol ou mélange 1:1 du phénol et du chloroforme entraînant la précipitation des protéines. Après centrifugation, les protéines précipitées migrent vers l’interface entre les phases organique et aqueuse, tandis que les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse. Pour les extraits de plantes, qui contiennent des quantités plus importantes de glucides que celles trouvées dans la plupart des cellules animales et microbiennes, une purification supplémentaire impliquant le détergent bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) est fréquemment utilisée. Ce composé se lie spécifiquement aux acides nucléiques, améliorant leur récupération lors de l’extraction du phénol. La plupart des procédures d’extraction comprennent également la digestion de l’ARN avec de la ribonucléase et un traitement final avec de l’éthanol, qui précipite les polymères d’acide nucléique restants, ce qui permet d’éliminer les ribonucléotides et autres contaminants de faibles poids moléculaires. L’ADN précipité est séché puis redissout dans de l’eau ou un tampon Tris-EDTA.

Préparation de l’ADN Plasmidique ou Phagique :

Des techniques spéciales doivent être utilisées si l’objectif est d’obtenir de l’ADN plasmidique ou celui du bactériophage à partir de clones bactériens. L’ADN plasmidique peut être obtenu par l’une quelconque de plusieurs techniques qui exploitent les différences physiques entre les plasmides et l’ADN génomique bactérien, les plasmides étant de petites molécules sur-enroulées alors que l’ADN génomique, après rupture cellulaire, est présent sous forme de longs fragments linéaires. Une méthode populaire implique le traitement de l’extrait cellulaire avec de l’alcali, qui précipite l’ADN linéaire mais laisse des plasmides super-enroulés en solution. L’ADN du bactériophage, par exemple les vecteurs recombinants l ou M13, sont habituellement obtenu directement à partir de particules de bactériophage sécrétées par des bactéries infectées, le procédé de purification étant simplifié par le fait que ces particules sont constituées uniquement d’ADN et de protéine. Techniques de transfert d’ADN Après que l’ADN purifié a été traité avec une ou plusieurs endonucléases de restriction, il est fractionné par électrophorèse sur gel d’agarose et le gel est ensuite pré-traité avant la mise en place du transfert de Southern. Le prétraitement a deux objectifs. Tout d’abord, il est souhaitable de briser les molécules d’ADN dans les bandes individuelles dans le gel en plus petits fragments, parce que les plus petits fragments sont transférés plus rapidement que les plus grands. Ceci est réalisé en trempant le gel dans 0,25 mol/lit de HCl pendant 30 min, ce qui entraîne une petite quantité de dépurination – clivage de la liaison bN-glycosidique entre les bases puriques (adénine ou guanine) et le composant sucre de leurs nucléotides – qui est suivie par la décomposition de la structure du sucre et la rupture de la chaîne polynucléotidique. Le deuxième prétraitement est avec une solution alcaline qui dénature les molécules d’ADN double brin par rupture de leurs liaisons hydrogène, de sorte que les molécules deviennent simple brin. Cela facilite leur transfert et leur liaison subséquente à la membrane, et garantit également qu’après la liaison, les composants d’appariement de bases des polynucléotides sont disponibles pour l’hybridation avec la sonde.

Si une membrane de nitrocellulose est utilisée, le prétraitement alcalin est suivi d’une neutralisation du gel par trempage dans un tampon Tris-sel, cette étape étant essentielle car l’ADN ne se lie pas à la nitrocellulose à un pH supérieur à 9,0. Le transfert de Southern est ensuite mis en place, comme illustré sur la figure 1, avec un tampon de transfert à haute teneur en sel, habituellement la formulation appelée ’20? SSC ‘, qui comprend 3,0 mol de NaCl L2 1 (sel) et 0,3 mol de citrate de sodium L 2 1. Le même tampon peut être utilisé pour le transfert sur une membrane de nylon, mais avec une membrane de nylon chargée positivement, un tampon de transfert alcalin (0,4 mol L2 1 NaOH) est utilisé car, comme décrit précédemment, ceci entraîne une fixation covalente immédiate de l’ADN transféré. à la membrane. Avec ce type de transfert, le prétraitement alcalin est inutile. Le transfert est ensuite laissé pendant au moins 18 heures pour un transfert à teneur élevée en sel, ou 2 heures pour un transfert alcalin. Après le transfert, le montage de transfert est démonté et la membrane est rincée à 2? SSC et laissé sécher. Si la tache a été faite sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon non chargée, alors l’ADN n’est que faiblement lié à la membrane à ce stade. Une immobilisation plus permanente doit donc être réalisée soit par cuisson à 808C pendant 2 h, ce qui entraîne une fixation non covalente mais semipermanente de l’ADN sur une membrane de nitrocellulose, soit une irradiation UV qui entraîne une fixation covalente de l’ADN sur une membrane de nylon. Hybridation d’ADN / ADN L’analyse d’hybridation est basée sur le principe que deux polynucléotides formeront un hybride stable par appariement de bases si leurs séquences nucléotidiques sont totalement ou partiellement complémentaires. Un fragment de restriction spécifique dans un transfert de Southern peut donc être détecté si la membrane est sondée avec une seconde molécule d’ADN marquée qui a la même séquence, ou une séquence similaire, que le fragment recherché. Nous étudierons les types de sondes d’hybridation qui peuvent être utilisées plus tard; Nous allons d’abord étudier la méthodologie utilisée pour l’analyse d’hybridation.

If a nitrocellulose membrane is being used then the alkali pretreatment is followed by neutralization of the gel by soaking in a Tris-salt buffer,this step being essential because DNA does not bind to nitrocellulose at a pH of greater than 9.0. The Southern blot is then set up,as illustrated in Figure 1,with a high-salt transfer buffer, usually the formulation called ‘20
SSC’,which comprises 3.0 mol L 2 1 NaCl (salt) and 0.3 mol L 2 1 sodium citrate. The same buffer can be used for transfer to a nylon membrane,but with a positively charged nylon membrane an alkaline transfer buffer (0.4 mol L 2 1 NaOH) is used because,as described earlier,this results in immediate covalent attachment of the transferred DNA to the membrane. With this type of transfer the alkali pretreatment is unnecessary. The blot is then left for at least 18 h for a high-salt transfer,or 2 h for an alkaline blot. After blotting,the transfer setup is dismantled and the membrane rinsed in 2
SSC and left to dry. If the blot has been made onto a nitrocellulose or uncharged nylon membrane,then the DNA is only loosely bound to the membrane at this stage. More permanent immobilization must therefore be carried out,either by baking at 808C for 2 h,which results in noncovalent but semipermanent attachment of DNA to a nitrocellulose membrane,or UV irradiation,which results in covalent attachment of DNA to a nylon membrane. DNA/DNA Hybridization Hybridization analysis is based on the principle that two polynucleotides will form a stable hybrid by base-pairing if their nucleotide sequences are wholly or partly complementary. A specific restriction fragment in a Southern blot can therefore be detected if the membrane is probed with a second,labelled DNA molecule that has the same,or similar,sequence as the fragment being sought. We will Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net 3 examine the types of hybridization probe that can be used later; first we will survey the methodology used for hybridization analysis.

Prehybridization of a Southern blot Hybridization analysis is carried out by soaking the Southern blot in a buffer containing the hybridization probe,usually in a tube that is constantly rotated so all parts of the membrane are exposed to the probe,or alternatively in a sealed plastic bag that is placed on a shaker. Hybridization is carried out in two stages. First,the membrane is prehybridized in a solution designed to block the unused DNA binding sites on the membrane surface. If this step is omitted then the probe will bind nonspecifically to the surface of the membrane and the signal resulting from hybridization to the specific restriction fragment will be difficult if not impossible to identify. The prehybridization solution therefore contains nonbiological polymeric compounds such as polyvinylpyrrolidone and/or biological polymers such as Ficoll (a carbohydrate-based compound),bovine serum albumin or dried milk. DNA from an organism unrelated to the one whose DNA has been blotted can also be used (salmon sperm DNA is a popular choice). Prehybridization takes between 15 min and 3 h at 688C,depending on the type of membrane. The hybridization and washing steps The second stage is the actual hybridization,which is carried out in a high-salt buffer containing a detergent, usually 2
SSC 1 1% SDS. Two issues are critical at this stage of the experiment. First,enough probe DNA must hybridize to the target restriction fragment to produce a clear signal that can be discerned by the detection system appropriate for the label carried by the probe. For the most demanding applicationsuch as detection of a single copy gene in human genomic DNA,achieving sufficient sensitivity might be a problem even if the maximum amount of genomic DNA is loaded on to the electrophoresis gel (in practice,about 10 mg of DNA per lane) and the probe has been labelled to its maximal specific activity (4 109 dpm mg 2 1 for a 32P radioactive label). Increasingly greater problems will be encountered if a radioactive label other than 32P is used,such as 35S,which is generally suitable only for probing less complex DNAs such as restricted plasmid or bacteriophage clones,or if a nonradioactive probe is employed. Under these circumstances some increase in sensitivity can be obtained by including an inert polymer such as 10% dextran sulfate or 8% polyethylene glycol 6000 in the hybridization solution. These polymers are thought to induce the probe molecules to form networks so that greater amounts of DNA hybridize to the target sites on the membrane. In practice, a 10- to 100-fold increase in sensitivity can be achieved (Amasino,1986). The second critical factor that must be considered during the hybridization step is the specificity of the reaction. If the probe DNA has been carefully chosen then it will contain a region that is completely complementary to all or a part of the blotted restriction fragment that is being sought. If this hybridizing region in the probe is not completely complementary to the target,then it will at least have a region of strong similarity so that a stable hybrid can form. The problem is that the probe also has the potential to hybridize to any other blotted DNA fragments with which it has partial complementarity. The hybridization experiment will never give an unambiguous signal if the probe is more similar to a second restriction fragment than it is to the one being sought,but problems with nonspecific hybridization can still arise even if the best match is with the specific target. This means that the hybridization step must be carried out at a ‘stringency’ that results in the specific probe–target hybrid remaining stable while all other hybrids are unstable,the stringency being determined by the composition of the hybridization buffer and the temperature at which the experiment is carried out. Buffer composition is relevant because hybrid stability is dependent on the ionic strength and the presence of destabilizing agents,such as formamide,which disrupt hydrogen bonds. Temperature is relevant because the melting temperature (Tm,the highest temperature at which the hybrid is stable) of a fully base-paired hybrid is higher than that for one in which some base pairs have not formed because the probe and target DNAs are not fully complementary. Formation of the desired hybrid,and destabilization of nonspecific hybrids,can therefore be achieved by utilizing an appropriate combination of buffer composition and hybridization temperature. A number of different strategies are possible. If the probe is 4100 bp in length,for example a cloned restriction fragment,then the initial hybridization is usually carried out at 688C in a high-salt buffer,this representing highly stringent conditions under which only stable hybrids are expected to form,with very little if any nonspecific hybridization. With this strategy,washing steps that are carried out after hybridization are designed simply to remove the nonhybridized probe. However,if a short oligonucleotide probe is used (15–25 nucleotides in length),then the hybridization step is usually carried out under conditions of low stringency (typically at a temperature several degrees below the calculated Tm for the desired hybrid),so that all potential hybrids,including nonspecific ones,are able to form. Specificity is then achieved by a series of washes at increasing temperatures so that,hopefully,only the desired hybrid remains at the end of the procedure. After washing,the membrane is subjected to the detection procedure appropriate for the label that has been used,for example autoradiography for a radioactive label. Subsequent reprobing is possible if the membrane is Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques 4 ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net ‘stripped’ by washing in a high-temperature buffer containing alkali and detergent to destabilize the hybridized DNA. This procedure is never wholly satisfactory as it is difficult to avoid removing some of the blotted DNA at the same time,so even nylon membranes carrying covalently bound DNA can only be reprobed ten or so times. Types of Hybridization Probes Any DNA molecule that is complementary to the restriction fragment being sought can be used as the probe. Depending on the application (see below),the probe might itself be a restriction fragment,or it might be a DNA molecule obtained by the polymerase chain reaction (PCR),or a cDNA prepared by complementary DNA synthesis from an mRNA template. Synthetic oligonucleotides are also frequently used as hybridization probes, especially when discrimination between very similar target DNAs is required. This is because oligonucleotides of 15– 25 nucleotides in length form hybrids whose melting temperatures can be estimated from the formula: Tm 5 (2
number of A and T nucleotides) 1 (4
number of G and C nucleotides) 8C The Tm values for most 15–25mer oligonucleotides fall between 40 and 908C. A single nonbase-paired nucleotide position in the hybrid between the oligonucleotide probe and target DNA can reduce the Tm by 3–58C,so careful control of the posthybridization wash temperature can distinguish a target site that is completely complementary to the probe from one that differs at just a single nucleotide position,enabling highly specific probing to be carried out. A second popular type of hybridization probe is one made of RNA rather than DNA. RNA probes have a number of advantages compared with their DNA counterparts,the most important of which in practical terms is the availability of methods for synthesis in the test tube of large amounts of an RNA probe from a DNA molecule that has been cloned adjacent to a promoter for a bacteriophage RNA polymerase. Starting with 1 mg of cloned DNA, purified T7 RNA polymerase,for example,can make up to 30 mg of RNA in 30 min,this RNA being labelled with a specific activity of over 109 dpm mg 2 1 if a 32P-labelled ribonucleotide is included in the reaction mixture. RNA probes also have the advantage of being single-stranded, which means that the effective probe concentration does not decline during the hybridization,as happens with a double-stranded DNA probe due to base-pairing of the two complementary probe molecules to one another. Applications and Limitations of Southern Blotting The applications of Southern blotting are diverse and are not easily summarized in a short article. Two examples will suffice to illustrate the range of research questions to which the technique can be applied. Southern blotting in clone identification The commonest applications of Southern blotting occur during projects aimed at identification and cloning of a specified gene. Southern blotting of genomic DNA is used to identify one or more restriction fragments that contain the gene being sought and,after cloning and tentative identification of the desired recombinant by colony or plaque hybridization probing,Southern blotting of restricted clone DNA is used to confirm the clone identification and possibly to locate a shorter restriction fragment, containing the sequence of interest,from within the cloned DNA. The latter application is important because the interesting gene sequence might be just a few kb in length but contained initially in a genomic clone of several hundred kb prepared with a high-capacity vector such as a bacterial or yeast artificial chromosome. For Southern blotting to be applicable to gene identification it is of course necessary to have a suitable hybridization probe,one that will detect specifically the one or more restriction fragments that contain the gene being sought. Often the gene will have already been cloned as a cDNA that can be used as a probe for identification of the genomic version of the gene. Alternatively,if the gene has been cloned from a related organism,one in which the gene sequence is likely to be similar to that in the organism now being studied, then heterologous probing can be used,in which some noncomplementarity between probe and target is tolerated during the hybridization step. This approach can be used, for example,to identify homologues of human genes in the genomes of other primates,and can even be used across broad species barriers,for example by using Drosophila genes as probes for related human sequences. Another possibility is to use the amino acid sequence of the protein coded by the desired gene to design a mixed oligonucleotide probe,one that consists of a variety of related sequences that together include all the combinations that would code for a short segment of the amino acid sequence. For example,the mixed oligonucleotide 5’-AA(C/U)GA(A/ G)AUGUU(C/U)UGGUA(C/U)GG-3’,which contains sixteen different sequences,covers all possibilities for the amino acid sequence asparagine-glutamine-methioninephenylalanine-tryptophan-tyrosine-glycine and would be expected to detect the DNA sequence coding for this protein segment when used at a sufficiently high stringency in a Southern hybridization experiment. Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net 5 Restriction fragment length polymorphism analysis The second major application of Southern hybridization is in the technique called restriction fragment length polymorphism (RFLP) mapping,which is important in construction of genome maps (Brown,1999). Treatment of genomic DNA from different individuals with a single restriction enzyme does not always give the same set of fragments because some restriction sites are polymorphic, being present in some individuals but absent in others, usually because a point change in the nucleotide sequence changes the restriction site into a sequence not recognized by the restriction enzyme. These polymorphic sites can be used as markers in genetic mapping and were of considerable importance in construction of the first comprehensive human maps (Donis-Keller et al.,1987),there being about 105 RFLPs in the human genome. RFLPs are typed by Southern blotting as shown in Figure 2,the probe being a DNA fragment that spans the polymorphic region (possibly one of the polymorphic fragments,possibly a fragment prepared by cutting the DNA with a different restriction enzyme,or possibly a fragment obtained by PCR) and the presence or absence of the polymorphic site determined from the size(s) of the restriction fragment(s) detected after Southern blotting. Summary Southern blotting is a technique that enables a specific restriction fragment to be detected against a background of many other restriction fragments. It involves transfer of DNA fragments from an electrophoresis gel to a nitrocellulose or nylon membrane in such a way that the DNA banding pattern present in the gel is reproduced on the membrane. Hybridization probing is then used to detect the restriction fragment that is being sought. The basic methodology for Southern blotting has not changed since the original technique was described in 1975,but modifications have been introduced with the aim of speeding up the process and achieving a more efficient transfer. Southern blotting has many applications in molecular biology, including the identification of one or more restriction fragments that contain a gene or other DNA sequence of interest,and in the detection of RFLPs used in construction of genomic maps. References Amasino RM (1986) Acceleration of nucleic acid hybridization rate by polyethylene glycol. Analytical Biochemistry 152: 304–307. Bittner M,Kupferer P and Morris CF (1980) Electrophoretic transfer of proteins and nucleic acids from slab gels to diazobenzyloxymethyl cellulose or nitrocellulose sheets. Analytical Biochemistry 102: 459– 471. Brown TA (1999) Genomes. Oxford: BIOS Scientific Publishers. Donis-Keller H,Green P,Helms C et al. (1987) A genetic map of the human genome. Cell 51: 319–337. Southern EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98: 503–517. Further Reading Ausubel FM,Brent R,Kingston RE et al. (eds) (1993) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley. Brown TA (1995) Gene Cloning: An Introduction,3rd edn. London: Chapman & Hall. Brown TA (1998) Molecular Biology Labfax. London: Academic Press. Dyson NJ (1991) Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis. In: Brown TA (ed.) Essential Molecular Biology: A Practical Approach,vol. 2,pp. 111–156. Oxford: Oxford University Press. Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory. Watson JD,Gilman M,Witkowski J and Zoller M (1992) Recombinant DNA,2nd edn. New York: WH Freeman. Nylon membrane Autoradiograph Hybridizing bonds 2 3 R1 R2 R3 DNA probe Restriction site map Polymorphic site Figure 2 Detection of an RFLP by Southern blotting. In this example, lane 2 contains DNA that lacks the polymorphic restriction site R2, and so contains a single restriction fragment that hybridizes with the probe. The DNA in lane 2 contains the polymorphic site and so yields two fragments that hybridize with the probe. Reproduced from Brown (1999) with permission of BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford. Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques 6 ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group /