Mettre l’ADN dans les cellules

Après que la séquence d’ADN à cloner a été joint au vecteur approprié, l’hybride doit être transféré dans des cellules pour l’amplification biologique. Le phénomène de la transformation des pneumocoques par l’ADN est connue depuis 1944. Une fois les propriétés génétiques souhaitables d’ E.coli ont été réalisées, elle aussi a été testée dans des expériences de transformation. Elles ont été infructueuses pendant de nombreuses années. Contre toute attente, un procédé de transformation d’E. coli a été découvert.

La Réintroduction d’une molécule d’ADN contenant un réplicon dans une cellule permet une amplification biologique de cette cellule à plus de 10 exposant 12. En un seul jour, une seule molécule peut être amplifiée à des quantités suffisantes pour des expériences physiques. La clé des protocoles de transformation initiale de E. coli a été le  traitement des cellules avec des ions calcium ou de rubidium pour les rendre compétentes pour l’absorption du plasmide ou de l’ADN du phage. Le terme transformation avec de l’ADN du phage qui donne alors une cellule infectée est une transfection, et ce terme est aussi  utilisé pour l’infection des cellules supérieurs avec l’ADN non viral. La levure peut être transfecté après un traitement qui comprend l’incubation, en présence d’ions lithium. Certains types de cellules de mammifère, des cellules L de souris, par exemple, peuvent être transfectés simplement en les arrosant avec un mélange de l’ADN et du phosphate de calcium cristaux. Ici, le mécanisme de transfection semble être l’absorption du complexe ADN-phosphate de calcium.

La Microinjection :

l’injection manuelle directe de petites quantités d’ADN dans les cellules a été très utile pour l’étude des fragments d’ADN clonés, car elle élimine la nécessité d’un réplicon ou un gène eucaryote sélectionnable. La microinjection dans les ovocytes de la grenouille Xenopus laevis a donné beaucoup d’information et la micro-injection dans des cellules de mammifère en culture est également possible. ADN injecté dans les cellules de Xenopus est transcrit pendant de nombreuses heures et traduit en quantités facilement détectables de protéine. En conséquence  un segment d’ADN peut être clones sur un plasmide tel que pBR322, manipulé in vitro et injectée dans les cellules pour examiner ses nouvelles propriétés biologiques. La microinjection est également possible dans un embryon de souris fertilisés. L’embryon peut alors être réimplanté à une souris pour se développer. Étant donné que les fragments d’ADN injecté se recombinent dans le chromosome, les souris seront transfectées par l’ADN. Pour que toutes les cellules de souris transfectée possèdent le même patrimoine génétique le fragment injecté doit recombiner dans une cellule de lignée germinale. Une telle souris est peu susceptible d’être génétiquement homogène car probablement les fragments similaires n’ont probablement pas intégrés dans les cellules somatiques. La progéniture d’une telle souris cependant peut être  génétiquement homogène, et celle-ci peut être étudiée  .

L’ Electroporation :

Une autre méthode générale pour incorporer de l’ADN dans les cellules est l’électroporation. Les cellules sont soumises à un champ électrique brève mais intense. Ce-ci crée de petits trous dans leurs membranes et pour une courte durée  les ADN présents dans la solution peuvent être absornéspar les cellules

Clonage à partir d’ARN :

Bien que l’ADN peut être extrait à partir des cellules et utilisé dans les étapes de clonage, parfois l’ARN est un meilleur choix de départ pour le clonage. Non seulement les séquences intermédiaires  peuvent être manquantes à partir d’ARNm, mais souvent l’ARNm extrait à partir de certains tissus est fortement enrichi pour les séquences de gènes spécifiques. Extraction de l’ARN à partir des cellules donne une prépondérance d’ ARN  ribosomal. L’ARN messager peut facilement être séparé de cet ARN ribosomal puisque la plupart des ARN messager de la plupart des organismes supérieurs contiennet une queue poly-A à l’extrémité 3 ‘. Cette queue peut être utilisé pour l’isolement en faisant passer une fraction brute de l’ARN cellulaire à travers une colonne de cellulose dans laquelle poly-dT a été lié. À des concentrations élevées en sel, les poly-dT qui sont reliées à la colonne et les queues poly-A des molécules qui sont  lieés aux ARN messagers de la colonne. Les molécules d’ARN ribosomique circulent librement à travers la colonne. Les ARN messagers sont sont libérés par abaissement de la concentration en sel de manière à affaiblir le poly-dT hybrides. Une telle étape de purification fournit souvent un plusieurs-centuple d’enrichissement pour l’ARN messager. L’effort nécessaire pour cloner le gène spécifique est souvent fortement réduite par l’utilisation de cette procédure en conjonction avec le choix d’un tissu particulier à un développement particulier. L’ARN simple brin obtenu par les étapes décrites ci-dessus ne peut pas être directement clonés. Ou bien l’ARN peut être converti en ADN par l’intermédiaire d’un brin complémentaire, l’ADNc ou l’ARN peut être utilisé pour faciliter l’identification d’un clone contenant la séquence d’ADN complémentaire. À générer une copie d’ADNc du messager poly-A contenant, plusieurs étapes sont effectuées . Tout d’abord, une amorce poly-dT est hybridée à l’ARN  messager et la transcriptase inverse est utilisé pour allonger l’apprêt et produire une copie de l’ADN. Cette enzyme, qui se trouve à l’intérieur du virus libre des particules de certains virus animaux, la synthèse de l’ADN en utilisant une matrice d’ARN. A ce stade, la séquence existe sous la forme d’un hybride ARN-ADN. Ceci se converti en un duplex d’ADN par incubation simultanée avec la RNAse H, qui coupe le brin d’ARN dans un duplex ARN-ADN et ADN polymérase  pol I supprime le reste de l’ARN par translation de coupure. Enfin, pour rendre les extrémités du duplex d’ADN parfaitement émoussé, l’ADN polymerase T4 pol I est ajouté. L’ADN double brin ainsi obtenu peut ensuite être cloné par des méthodes déjà discutées.

Hybridation de Plaque et de  Colonie pour l’identification de  Clone :

De nombreuses techniques ont été mises au point pour la détection des clones souhaités. Un des plus simples est la sélection génétique (Fig. 9.13). Le plus souvent cette simple avenue ne sont pas disponibles, mais on possède une séquence apparentée. Parfois, cette séquence apparentée provient d’un gène analogue au gène désiré, mais à partir d’un organisme différent. D’autres fois, des séquences d’acides aminés sont connues ou bien une approximation peut être faite quant à la la séquence des acides aminés. A partir de ces séquences, les séquences d’ADN peuvent être

Une variété de techniques de criblage direct existent pour la détection d’un gène cloné. Dans ces approches,le clonage de l’ADN étranger dans un vecteur lambda est pratique parce que le phage peut accueillir des fragments insérés de grande dimension et un grand nombre de phage lambda peuvent être criblés sur une seule boite de petri . La collection de phage candidat est appelé une banque lambda ou d’une bibliothèque.
Il est étalé sur des milliers de plaques par plaque. Ensuite, une copie de la réplique de
les plaques de phage est réalisé en appuyant sur un papier filtre sur la plaque. Après
le papier est enlevé, il est immergé dans une solution alcaline. Par ces étapes l’ADN
est dénaturé et fixé sur le papier. L’ARN marqué radioactivement puis
ou de l’ADN, appelé une sonde est hybridée à un ADN quelconque complémentaire
séquences en images de plaque sur le papier. La sonde contient la connue
séquence dérivée d’un clone isolé au préalable ou d’une séquence déduite
à partir des informations de séquence amino-acide. L’emplacement des zones
avec sonde liée sont ensuite déterminées par autoradiographie, et viable
phagique contenant l’insert désiré peut être isolé à partir du composé
la position sur la plaque originale. techniques analogues existent pour le dépistage
les colonies contenant les plasmides.
Marcher le long d’une Chromosome cloner un gène
Une autre méthode de clonage d’un gène désiré est la marche. Supposons qu’un hasard
clone isolé a été montré pour se situer à l’intérieur de plusieurs centaines
mille bases du segment d’ADN que nous souhaitons cloner. Bien sûr,
démontrant un tel fait est pas banal en soi. Dans le cas du fruit
mouche Drosophila melanogaster, cependant, la démonstration est simple.
Comme expliqué précédemment, les chromosomes polytènes dans les cellules de plusieurs
tissus de Drosophila possèdent des bandes caractéristiques qui servent de chromoso-
(une)
a fragments b c d clonées
une
b
c
(B)
ré
Composite carte de restriction du segment chromosomique
Restriction enzyme
des sites de clivage
La figure 9.14 (a) Un gel représentant des fragments d’ADN résultant d’une restriction
digestion enzymatique d’un ensemble de quatre séquences d’ADN se chevauchant partiellement. (B) Le
quatre ADN et leur composite.
284 génie génétique et l’ADN recombinant
repères mal. Par conséquent, l’ADN impliquée dans des réarrangements chromosomiques
ou suppressions peuvent être facilement observés. En outre ADN hautement radioactifs
provenant d’un segment clone de drosophile chromosomique peut être
hybridées in situ à drosophile chromosomes polytènes. La position à
que les fragments se hybride peuvent alors être déterminées par autoradiographie.
Par conséquent, la position chromosomique d’un fragment peut être clone
déterminé. Si elle se trouve à proximité d’un gène d’intérêt, la marche peut être dans l’ordre.
Une chromosomique à pied de cloner un gène spécifique commence par une restriction
carte de la pièce d’ADN clone. Le terminal de droite et de gauche-end
les fragments de restriction sont utilisées en tant que sondes d’une banque lambda. Plusieurs
Les clones sont choisis qui hybrident le fragment de droite et de ne pas
le fragment de gauche. Ensuite, les cartes de restriction de ces clones sont fabriqués
et encore les fragments de droite et de gauche sont utilisés pour trouver de nouveaux clones
qui hybrident uniquement aux fragments de droite (Fig. 9.14). successif
lambda transduction phage qui sont identifiés permis marche du
à droite, et lorsqu’une distance suffisante a été couverte, une hybridation in situ
permet de déterminer dans quelle direction sur l’ADN clone
correspond
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