Les principes fondamentaux de la préparation de l’ADN sont plus faciles à comprendre en examinant d’abord le type le plus simple de procédure de purification d’ADN, celui où le complément d’ADN entier d’une cellule bactérienne est nécessaire. Les modifications nécessaires pour la préparation d’ADN de plasmide et de phage peuvent ensuite être décrites ultérieurement. La procédure pour la préparation d’ADN totale à partir d’une culture de cellules bactériennes peut être divisée en quatre étapes :

1 Une culture de bactéries est lancée,  puis récoltée.
2 Les cellules sont brisées pour libérer leur contenu.
3 Cet extrait cellulaire est traité pour enlever tous les composants sauf l’ADN.
4 La solution d’ADN résultante est concentrée.

Cultiver et récolter une culture bactérienne :

La plupart des bactéries peuvent être cultivées sans trop de difficulté dans un milieu liquide (culture de bouillon). Le milieu de culture doit fournir un mélange équilibré des nutriments essentiels à des concentrations qui permettront aux bactéries de croître et de se diviser efficacement. Deux milieux de croissance typiques sont détaillés dans le tableau ci dessous. M9 est un exemple d’un milieu défini dans lequel tous les composants sont connus. Ce milieu contient un mélange de nutriments inorganiques pour fournir des éléments essentiels tels que l’azote, le magnésium et le calcium, ainsi que le glucose pour fournir du carbone et de l’énergie. En pratique, d’autres facteurs de croissance tels que les oligo-éléments et les vitamines doivent être ajoutés à M9 avant qu’il ne favorise la croissance bactérienne. Précisément quels suppléments sont nécessaires dépend des espèces concernées. Le second milieu décrit dans ce tableau est assez différent. Luria-Bertani (LB) est un milieu complexe ou indéfini, ce qui signifie que l’identité précise et la quantité de ses composantes ne sont pas connues. C’est parce que deux des ingrédients, tryptone et extrait de levure, sont des mélanges compliqués de composés chimiques inconnus. Tryptone fournit en effet des acides aminés et de petits peptides, alors que l’extrait de levure (une préparation séchée de cellules de levure partiellement digérées) fournit les besoins en azote, ainsi que des sucres et des nutriments inorganiques et organiques. Les milieux complexes tels que LB n’ont besoin d’aucune autre supplémentation et favorisent la croissance d’une large gamme d’espèces bactériennes. Les milieux définis doivent être utilisés lorsque la culture bactérienne doit être cultivée dans des conditions précisément contrôlées. Cependant, cela n’est pas nécessaire lorsque la culture est cultivée simplement comme une source d’ADN, et dans ces circonstances un milieu complexe est approprié. Dans un milieu LB à 37 ° C, aéré par secousses à 150-250 tr / min sur une plate-forme rotative, les cellules d’E. Coli se divisent une fois toutes les 20 minutes environ jusqu’à ce que la culture atteigne une densité maximale d’environ 2-3 x 109 cellules / ml.

La croissance de la culture peut être contrôlée en lisant la densité optique (OD) à 600 nm , dans ces conditions  1 unité OD correspond à environ 0,8 x 109 cellules / ml.

Pour préparer un extrait cellulaire, les bactéries doivent être obtenues dans un volume aussi petit que possible. La récolte est donc effectuée en faisant tourner la culture dans une centrifugeuse. Des vitesses de centrifugation assez faibles vont précipiter les bactéries au fond du tube de centrifugation, ce qui permet d’éliminer le liquide du milieu de culture. Ainsi les bactéries d’une culture de 1000 ml à densité cellulaire maximale peuvent alors être remises en suspension dans un volume de 10 ml ou moins.

Préparation d’un extrait cellulaire:

La cellule bactérienne est enfermée dans une membrane cytoplasmique et entourée d’une parois cellulaire rigide. Avec certaines espèces, dont E. coli, la paroi cellulaire peut elle-même être enveloppée par un deuxième parois, la membrane externe. Toutes ces barrières doivent être brisées pour libérer les composants cellulaires. Les techniques de rupture des cellules bactériennes peuvent être divisées en méthodes physiques, dans lesquels les cellules sont perturbées par des forces mécaniques, et des procédés chimiques, où la lyse cellulaire est provoquée par l’exposition à des agents chimiques qui affectent l’intégrité de la barrière cellulaire. Les méthodes chimiques sont les plus couramment utilisées avec les cellules bactériennes lorsque le but est la préparation d’ADN. La lyse chimique implique généralement un agent attaquant la paroi cellulaire et un autre Perturbant la membrane cellulaire (figure 3.4a). Les produits chimiques utilisés dépendent des bactéries concernées mais avec E. coli et les organismes apparentés, l’affaiblissement de la paroi cellulaire est habituellement provoquée par le lysozyme, le tétraacétate d’éthylènediamine (EDTA), Ou une combinaison des deux. Le lysozyme est une enzyme présente dans le blanc d’œuf et Sécrétions telles que les larmes et la salive, et qui digère les composés polymères donnent à la paroi cellulaire sa rigidité. L’EDTA élimine les ions magnésium qui sont essentiels à la conservation de la structure globale de l’enveloppe cellulaire, et inhibe également les enzymes cellulaires qui pourrait dégrader l’ADN. Dans certaines conditions, l’affaiblissement de la paroi cellulaire avec le lysozyme ou L’EDTA est suffisant pour provoquer l’éclatement des cellules bactériennes, mais habituellement un détergent tel que le sodium dodécylsulfate(SDS) est également ajouté. Les détergents aident le processus de lyse en éliminant les ipides de la membrane et en provoquent ainsi une destruction des membranes cellulaires. Après avoir lysé les cellules, l’étape finale dans la préparation d’un extrait cellulaire est l’élimination de Débris cellulaires insolubles. Des composants tels que des fractions de parois cellulaires partiellement digérées peuvent être séparées par centrifugation, laissant l’extrait de cellule comme étant un sur surnageant raisonnablement limpide.

Purification of DNA from a cell extract :

En plus de l’ADN, un extrait cellulaire bactérien contient des quantités significatives de protéine et d’ARN. Divers procédés peuvent être utilisés pour purifier l’ADN de ce mélange. Une approche consiste à traiter le mélange avec des réactifs qui dégradent les contaminants, laissant une solution pure d’ADN (figure 3.5a). D’autres procédés utilisent la chromatographie par échange d’ions pour séparer le mélange en ses différents composants, de sorte que l’ADN est séparé des protéines et de l’ARN dans l’extrait (figure 3.5b). L’élimination des contaminants par extraction organique et digestion enzymatique est une procédée connue de déprotéinisation d’ un extrait cellulaire et  consiste à ajouter du phénol ou un mélange 1: 1 de phénol et de chloroforme à la solution. Ces solvants organiques précipitent des protéines mais laissent les acides nucléiques (ADN et ARN) en solution aqueuse. Le résultat est que si l’extrait cellulaire est mélangé doucement avec le solvant et centrifugé , les molécules de protéines précipitées seront sous la forme d’une masse coagulée blanche à l’interface entre les couches aqueuse et organique (figure 3.6).

La solution aqueuse d’acides nucléiques peut alors être séparée avec une pipette. Avec certains extraits cellulaires, la teneur en protéines est tellement grande qu’une extraction phénolique unique n’est pas suffisante pour purifier complètement les acides nucléiques. Ce problème pourrait être résolu en effectuant plusieurs extractions de phénol les unes après les autres, mais cela n’est pas souhaitable car chaque étape de mélange et de centrifugation entraîne une certaine quantité de rupture des molécules d’ADN. La réponse est de traiter l’extrait cellulaire avec une protéase telle que la pronase ou protéinase K avant l’extraction du phénol. Ces enzymes brisent les polypeptides des unités plus petites, qui sont plus faciles à éliminer par le phénol. Certaines molécules d’ARN, en particulier l’ARN messager (ARNm), sont éliminées par le phénol mais la plupart restent avec l’ADN dans la couche aqueuse. Le seul moyen efficace pour éliminer l’ARN est avec l’enzyme ribonucléase, ce qui dégrade rapidement ces molécules dans les sous-unités ribonucléotidiques.

Utilisation de la Chromatographie par échange d’ions pour purifier l’ADN d’un extrait cellulaire:

Les biochimistes ont mis au point divers procédés pour utiliser des différences de charge électrique des  mélanges pour séparer des produits chimiques à leurs composants individuels. Une de ces méthodes est la chromatographie par échange d’ions, qui sépare les molécules selon leur l’intensité de liaison électrique à des particules chargées présentes dans une matrice chromatographique ourésine. L’ADN et l’ARN sont tous les deux chargés négativement, tout comme certaines protéines, et se lient ainsi à une résine chargée positivement. La fixation électrique est interrompue par le sel, ainsi l’élimination des molécules plus étroitement liées nécessitant des concentrations plus élevées de sel. En augmentant progressivement la concentration en sel, différents types de molécules peuvent être détachés de la résine l’un après l’autre. La manière la plus simple d’effectuer une chromatographie par échange d’ions est de placer la résine dans une colonne de verre ou de plastique, puis ajouter l’extrait de cellule au sommet . L’ extrait passe à travers la colonne, et parce que cet extrait contient très peu de sel toutes les molécules chargées négativement se lient à la résine et sont retenues dans la colonne. Si une solution saline de concentration progressivement croissante est maintenant passée à travers la colonne, les différents types de molécules vont se détacher de la résine dans l’ordre : la protéine, ARN, et enfin l’ADN. Toutefois, une telle séparation minutieuse n’est généralement pas nécessaire et deux solutions salines, dont la concentration est suffisante pour séparer  la protéine et ARN, laissant seulement l’ADN lié, suivi d’une seconde d’une concentration plus élevée Qui élue l’ADN, maintenant exempt de protéines et d’ARN contaminants.

La concentration d’échantillons d’ADN :

L’extraction organique aboutit souvent à une solution d’ADN très concentrée qui n’a plus besoin d’être concentrée. D’autres procédés de purification donnent des solutions plus diluées et il est donc important de considérer des procédés pour augmenter la concentration d’ADN. La méthode de concentration la plus fréquemment utilisée est la précipitation à l’éthanol. En présence de sel (à proprement parler, des cations monovalents tels que les ions sodium (Na +)), et à une température de -20 ° C ou moins, l’éthanol absolu précipite efficacement des acides nucléiques polymères. Avec une solution d’ADN concentrée, l’éthanol peut flotter sur le dessus de l’échantillon, ce qui provoque la précipitation des molécules à l’interface. Un truc spectaculaire est de pousser une tige de verre à travers l’éthanol dans la solution d’ADN. Lorsque la tige est retirée, les molécules d’ADN adhèrent et peuvent être retirées de la solution sous la forme d’une longue fibre (figure 3.8a). En variante, si l’éthanol est mélangé avec une solution d’ADN diluée, le précipité peut être recueilli par centrifugation (figure 3.8b), puis redissous dans un volume approprié d’eau. La précipitation à l’éthanol présente l’avantage supplémentaire de laisser des composants d’acides nucléiques à chaîne courte et monomères en solution. Les ribonucléotides produits par le traitement à la ribonucléase sont donc perdus à ce stade.

La mesure de la concentration d’ADN :

Il est crucial de savoir exactement combien d’ADN est présent dans une solution lors de la réalisation d’une expérience de clonage de gène. Heureusement, les concentrations d’ADN peuvent être mesurées avec précision par spectrophotométrie par absorption ultraviolette (UV). La quantité de rayonnement UV absorbée par une solution d’ADN est directement proportionnelle à la quantité d’ADN dans l’échantillon. Habituellement, l’absorbance est mesurée à 260 nm, à cette longueur d’onde (A260) une absorbance de 1,0 correspond à 50 mg d’ADN bicaténaire par ml. Des mesures d’une solution d’ADN aussi peu que 1 fl peuvent être réalisées dans des spectrophotomètres conçus spécialement à cet effet. L’absorbance ultraviolette peut également être utilisée pour vérifier la pureté d’une préparation d’ADN. Avec un échantillon pur d’ADN, le rapport des absorbances à 260 et 280 nm (A260 / A280) est de 1,8. Des rapports inférieurs à 1,8 indiquent que la préparation est contaminée, soit avec des protéines, soit avec du phénol.

D’autres procédés pour la préparation d’ADN cellulaire total

Les bactéries ne sont pas les seuls organismes dont l’ADN peut être nécessaire. ADN cellulaire total par exemple des plantes ou des animaux seront nécessaires si le but du projet de génie génétique est de cloner des gènes de ces organismes. Bien que les étapes fondamentales de la purification de l’ADN sont les mêmes, quel que soit l’organisme, certaines modifications devront être introduites pour tenir compte des particularités des cellules utilisées. Évidemment, la croissance des cellules en milieu liquide ne convient que pour les bactéries, des microorganismes et des cultures de cellules végétales et animales sont plus spécifiques. Des modifications majeures, sont susceptibles d’être nécessaires à l’étape de rupture cellulaire. Les produits chimiques utilisés pour les bactéries ne marchent pas habituellement avec d’autres organismes: le lysozyme, par exemple, n’a aucun effet sur les cellules végétales. Des enzymes de dégradation spécifiques sont disponibles pour la plupart des types de parois cellulaires, mais souvent des techniques physiques, telles que le broyage de matériel congelé avec un mortier et pilon, sont plus efficaces. D’autre part, la plupart des cellules animales n’ont pas de paroi cellulaire du tout, et peuvent être lysées simplement par traitement avec un détergent.

Une autre considération importante est la teneur biochimique des cellules dont L’ADN est extrait. Avec la plupart des bactéries, les principaux produits biochimiques qui sont  présents dans un extrait cellulaire sont la protéine, l’ADN et l’ARN donc l’extraction du phénol et/ou le traitement par la protéase, Suivi par l’élimination de l’ARN avec la ribonucléase, laisse un échantillon d’ADN pur. Ces traitements ne peuvent cependant pas être suffisants pour donner de l’ADN pur si les cellules contiennent également des quantités importantes d’autres produits biochimiques. Les tissus végétaux sont particulièrement difficiles parce qu’ils contiennent souvent de grandes quantités d’hydrates de carbone qui ne sont pas éliminés par l’extraction au phénol. Il faut plutôt adopter une approche différente. Une méthode utilise D’un détergent appelé bromure de cétyltriméthylammonium (BCTA), qui forme un complexe  Insoluble avec des acides nucléiques.

Lorsque le BCTA (bromure de cétyltriméthylammonium) est ajouté à un extrait de cellule végétale, le complexe acide nucléique-BCTA précipite, laissant des glucides, des protéines et d’autres contaminants dans le surnageant. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation et remis en suspension dans du chlorure de sodium 1 M, ce qui provoque la décomposition du complexe. Les acides nucléiques peuvent maintenant être concentrés par précipitation à l’éthanol et L’ARN éliminé par traitement par ribonucléase. La nécessité d’adapter les méthodes d’extraction organique pour tenir compte des contenus biochimiques de différents types de produits de départ a stimulé la recherche de méthodes de purification d’ADN utilisables avec n’importe quelle espèce. C’est une des raisons pour lesquelles la chromatographie par échange d’ions est devenue si populaire. Une méthode similaire implique un composé appelé thiocyanate de guanidinium, qui a deux propriétés qui le rendent utile pour la purification de l’ADN. Tout d’abord, il dénature et dissout tous les produits biochimiques autres que les acides nucléiques et peut donc être utilisé pour libérer de l’ADN de pratiquement n’importe quel type de cellule ou de tissu. Deuxièmement, en présence de thiocyanate de guanidinium, l’ADN se lie étroitement aux particules de silice (figure 3.10a). Ceci fournit un moyen facile de récupérer l’ADN du mélange dénaturé de produits biochimiques. Une possibilité est d’ajouter la silice directement à l’extrait de cellule mais, comme avec les procédés d’échange d’ions, il est plus commode d’utiliser une colonne de Chromatographie. La silice est placée dans la colonne et l’extrait de cellule ajouté (figure 3.10b). L’ADN se lie à la silice et est retenu dans la colonne, tandis que les produits biochimiques dénaturés passent tout droit. Après lavage des derniers contaminants avec une solution de thiocyanate de guanidinium, l’ADN est récupéré en ajoutant de l’eau, ce qui déstabilise les interactions entre les molécules d’ADN et la silice.