Des efforts considérables ont été déployés pour développer des systèmes de vecteurs pour le clonage des cellules animales. Ces vecteurs sont nécessaires en biotechnologie pour la synthèse de protéines recombinantes à partir de gènes qui ne sont pas exprimés correctement lorsqu’ils sont clones dans E. coli ou la levure et les méthodes de clonage chez l’homme sont recherchées par des biologistes moléculaires cliniques essayant de concevoir des techniques pour La thérapie génique dans laquelle une maladie est traitée par introduction d’un gène clone chez le patient. la majeure partie de l’attention a été portée sur les systèmes de clonage pour les mammifères, mais des progrès importants ont également été réalisés avec les insectes. Le clonage chez les insectes est intéressant car il fait appel à un nouveau type de vecteur que nous n’avons pas encore rencontré.
En plus de se déplacer d’une position à une autre au sein d’un même chromosome, les éléments P peuvent également sauter entre les chromosomes ou entre un plasmide portant un élément P et un des chromosomes de la mouche (figure 7.18b). Ce dernier est la clé de l’utilisation des éléments P comme vecteurs de clonage. Le vecteur est un plasmide qui porte deux éléments P, dont l’un contient le site d’insertion de l’ADN qui sera cloné. L’insertion du nouvel ADN dans cet élément P entraîne une perturbation de son gène transposase, de sorte que cet élément est inactif. Le second élément P porté par le plasmide est donc celui qui a une version intacte du gène de transposase. Idéalement, ce second élément ne devrait pas être transféré aux chromosomes de Drosophila, il a donc ses «ailes clippées»: ses répétitions inversées sont supprimées afin que la transposase ne le reconnaisse pas comme un élément P réel (Figure 7.17c).
Les vecteurs de clonages pour insectes :
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été et est encore l’un des organismes modèles les plus importants utilisés par les biologistes. Son potentiel a d’abord été reconnu par le généticien célèbre Thomas Hunt Morgan, qui, en 1910 a commencé à effectuer des croisements génétiques entre les mouches des fruits avec différentes couleurs des yeux, des formes du corps, et d’autres caractéristiques héritées. Ces expériences ont conduit aux techniques encore utilisées aujourd’hui pour la cartographie des gènes chez les insectes et d’autres animaux. Plus récemment, la découverte que les gènes sélecteurs homéotiques de Drosophila, les gènes qui contrôlent le plan global du corps de la mouche des fruits sont étroitement liés à des gènes équivalents chez les mammifères, a conduit à ce que le D. melanogaster soit utilisé comme modèle pour l’étude du développement de l’homme. L’importance de la mouche des fruits dans la biologie moderne est liée au fait que les vecteurs de clonage dans cet organisme sont disponibles.Le développement des vecteurs de clonage pour la Drosophile a pris une voie différente de celle suivie pour les bactéries, les levures, les plantes et les mammifères. Aucun plasmide n’est connu dans la Drosophile et bien que les mouches des fruits, comme tous les organismes, soient sensibles à l’infection par les virus, ils n’ont pas été utilisés comme base pour les vecteurs de clonage. Au lieu de cela, le clonage de la Drosophile utilise un transposon appelé l’élément P. Les transposons sont communs à tous les types d’organismes. Ce sont des fragments courts d’ADN (généralement moins de 10 kb de longueur) qui peuvent se déplacer d’une position à l’autre dans les chromosomes d’une cellule.
Les éléments P comme vecteurs de clonage de Drosophila :
Le développement des vecteurs de clonage pour la Drosophile a pris une voie différente de celle suivie pour les bactéries, les levures, les plantes et les mammifères. Aucun plasmide n’est connu dans la Drosophile et bien que les mouches des fruits, comme tous les organismes, soient sensibles à l’infection par les virus, ils n’ont pas été utilisés comme base pour les vecteurs de clonage. Au lieu de cela, le clonage de la Drosophile utilise un transposon appelé l’élément P. Les transposons sont communs à tous les types d’organismes. Ce sont des fragments courts d’ADN (généralement moins de 10 kb de longueur) qui peuvent se déplacer d’une position à l’autre dans les chromosomes d’une cellule.Les éléments P, qui sont l’un des plusieurs types de transposons dans la Drosophile, ont une longueur de 2,9 kb et contiennent trois gènes flanqués de séquences répétées inversées courtes à chaque extrémité de l’élément. Les gènes codent pour la transposase, l’enzyme qui effectue le processus de transposition et les répétitions inversées forment les séquences de reconnaissance qui permettent à l’enzyme d’identifier les deux extrémités du transposon inséré.
Les éléments P, qui sont l’un des plusieurs types de transposons dans la Drosophile, ont une longueur de 2,9 kb et contiennent trois gènes flanqués de séquences répétées inversées courtes à chaque extrémité de l’élément. Les gènes codent pour la transposase, l’enzyme qui effectue le processus de transposition et les répétitions inversées forment les séquences de reconnaissance qui permettent à l’enzyme d’identifier les deux extrémités du transposon inséré.
En plus de se déplacer d’une position à une autre au sein d’un même chromosome, les éléments P peuvent également sauter entre les chromosomes ou entre un plasmide portant un élément P et un des chromosomes de la mouche. Ce dernier est la clé de l’utilisation des éléments P comme vecteurs de clonage. Le vecteur est un plasmide qui porte deux éléments P, dont l’un contient le site d’insertion de l’ADN qui sera cloné. L’insertion du nouvel ADN dans cet élément P entraîne une perturbation de son gène transposase, de sorte que cet élément est inactif. Le second élément P porté par le plasmide est donc celui qui a une version intacte du gène de transposase. Idéalement, ce second élément ne devrait pas être transféré aux chromosomes de Drosophila, il a donc ses «ailes clippées»: ses répétitions inversées sont supprimées afin que la transposase ne le reconnaisse pas comme un élément P réel.
Une fois que le gène à cloner a été inséré dans le vecteur, l’ADN plasmidique est micro-injecté dans des embryons de mouches de fruit. La transposase de l’élément P qui est découpé de ses ailes, dirige le transfert de l’élément P transformé dans l’un des chromosomes de la mouche des fruits. Si cela se produit dans un noyau germinal, alors la mouche adulte qui se développe à partir de l’embryon portera des copies du gène cloné dans toutes ses cellules. Le clonage des éléments P a été développé dans les années 1980 et a apporté un certain nombre de contributions importantes à la génétique de la drosophile.
Bien que les vecteurs de virus n’aient pas été développés pour le clonage de gènes chez la drosophile, un type de virus, le baculovirus, a joué un rôle important dans le clonage de gènes avec d’autres insectes. L’utilisation principale de vecteurs de baculovirus est dans la production de protéine recombinante.
Les vecteurs de clonage à base de virus d’insectes:
Bien que les vecteurs de virus n’aient pas été développés pour le clonage de gènes chez la drosophile, un type de virus, le baculovirus, a joué un rôle important dans le clonage de gènes avec d’autres insectes. L’utilisation principale de vecteurs de baculovirus est dans la production de protéine recombinante.
Clonage chez les mammifères :
à l’heure actuelle, le clonage de gènes chez les mammifères est réalisé pour l’une des trois raisons suivantes:
1) pour obtenir un knock-out de gène, qui est une technique importante utilisée pour aider à déterminer la fonction d’un gène non identifié. Ces expériences sont généralement réalisées avec des rongeurs tels que des souris.
2) Pour la production de protéine recombinante dans une culture de cellules de mammifère, et dans la technique apparentée de pharming, qui implique le génie génétique d’un animal de ferme de sorte qu’il synthétise une protéine importante telle qu’un produit pharmaceutique, souvent Dans son lait .
3) En thérapie génique, dans laquelle des cellules humaines sont manipulées pour traiter une maladie.
Les virus comme vecteurs de clonage pour les mammifères :
Pendant de nombreuses années, on pensait que les virus allaient jouer un rôle clé dans le clonage des mammifères. Cette attente n’est que partiellement réalisée. La première expérience de clonage impliquant des cellules de mammifères a été réalisée en 1979 avec un vecteur à base de virus simien 40 (SV40).
Ce virus est capable d’infecter plusieurs espèces de mammifères, suivant un cycle lytique chez certains hôtes et un cycle lysogène chez d’autres. Le génome a une taille de 5,2 kb et contient deux ensembles de gènes, les gènes « précoces », exprimés au début du cycle d’infection et codant pour les protéines impliquées dans la réplication de l’ADN viral, et les gènes « tardifs » codant pour Protéines de capside virale. SV40 souffre du même problème que les caulimovirus des plantes, dans la mesure où les contraintes d’emballage limitent la quantité d’ADN nouveau qui peut être inséré dans le génome. Le clonage avec SV40 implique donc le remplacement d’un ou plusieurs des gènes existants par l’ADN à cloner. Dans l’expérience initiale, un segment de la région du gène tardif a été remplacé, mais le remplacement du gène précoce est également une option. Depuis 1979, un certain nombre d’autres types de virus ont été utilisés pour cloner des gènes chez des mammifères :
A) Les adénovirus, qui permettent de cloner des fragments d’ADN allant jusqu’à 8 kb, donc an ADN plus long que ce qui est possible avec un vecteur SV40, bien que les adénovirus soient plus difficiles à manipuler car leurs génomes sont plus grands.
B) Les papillomavirus, qui ont également une capacité relativement élevée pour l’ADN inséré. Le papillomavirus bovin (BPV), qui provoque des verrues sur le bétail, est particulièrement attrayant car il a un cycle d’infection inhabituel dans les cellules de souris, prenant la forme d’un plasmide multi-copie avec environ 100 molécules présentes par cellule. Il ne provoque pas la mort de la cellule de souris, et les molécules de BPV sont transmises à des cellules filles par division cellulaire, donnant lieu à une lignée cellulaire transformée en permanence. Des vecteurs navettes constitués de séquences BPV et E. coli, et capables de réplication dans des cellules de souris et bactériennes, ont été utilisés pour la production de protéines recombinantes dans des lignées cellulaires de souris.
C) Le virus adéno-associé (AAV), qui n’est pas lié à l’adénovirus mais qui se retrouve souvent dans les mêmes tissus infectés, car AAV utilise certaines des protéines synthétisées par les adénovirus pour achever son cycle de réplication. En l’absence de ce virus auxiliaire, le génome AAV s’insère dans l’ADN de son hôte. Come dans la plupart des virus intégratifs, il s’agit d’un événement aléatoire, mais l’AAV a la propriété inhabituelle de toujours s’insérer à la même position, au sein du chromosome humain 19. Il est important de savoir exactement où le gène cloné sera dans le génome hôte si le résultat de l’expérience de clonage doit être rigoureusement contrôlé, comme c’est le cas dans des applications telles que la thérapie génique. Les vecteurs AAV sont donc considérés comme ayant un potentiel majeur dans ce domaine.
D) Les rétrovirus, qui sont les vecteurs les plus couramment utilisés pour la thérapie génique. Bien qu’ils s’insèrent dans des positions aléatoires, les résultants sont très stables, ce qui signifie que les effets thérapeutiques du gène cloné persisteront pendant un certain temps. Nous reviendrons à la thérapie génique plus tard.L’une des raisons pour lesquelles les vecteurs de virus n’ont pas été généralisés dans le clonage de gènes de mammifères est parce qu’il a été découvert au début des années 1990 que la manière la plus efficace de transférer de nouveaux gènes dans des cellules de mammifères est par micro-injection. Bien qu’une procédure difficile à mettre en oeuvre, la micro-injection de plasmides bactériens, ou des copies d’ADN linéaires de gènes, dans des noyaux de mammifères conduit à l’insertion de l’ADN dans les chromosomes, éventuellement en multiples copies dans un agencement tandem tête-à-queue. ). Cette procédure est généralement considérée comme plus satisfaisante que l’utilisation d’un vecteur viral car elle évite la possibilité que l’ADN viral infecte les cellules et provoque des défauts quelconques. La micro-injection d’ADN est la base de la création d’un animal transgénique, qui contient un gène cloné dans toutes ses cellules. Une souris transgénique peut être générée par micro-injection d’un ovule fécondé qui est ensuite cultivé in vitro pour plusieurs divisions cellulaires et ensuite implanté dans une mère nourricière. En outre, une cellule embryonnaire peut aussi être utilisée. Celles-ci sont obtenus à partir d’un embryon précoce et, contrairement à la plupart des cellules de mammifères, sont totipotents, ce qui signifie que leur modèle de développement n’est pas prédéfini et les cellules descendantes peuvent former de nombreuses structures différentes chez la souris adulte. Après micro-injection, la cellule embryonnaire est replacée dans un embryon qui est implanté dans l’utérus de la mère. La souris résultante est une chimère, comprenant un mélange de cellules modifiées et non modifiées, car l’embryon qui reçoit la cellule manipulée contient également un certain nombre de cellules ordinaires qui contribuent, avec la cellule manipulée, à la composition de la Souris adulte. On obtient des souris non-chimères, qui contiennent le gène cloné dans toutes leurs cellules, en permettant à la chimère de se reproduire, car une partie de la progéniture sera dérivée d’ovules qui contiennent le gène cloné.
Clonage de gènes sans vecteur :
L’une des raisons pour lesquelles les vecteurs de virus n’ont pas été généralisés dans le clonage de gènes de mammifères est parce qu’il a été découvert au début des années 1990 que la manière la plus efficace de transférer de nouveaux gènes dans des cellules de mammifères est par micro-injection. Bien qu’une procédure difficile à mettre en oeuvre, la micro-injection de plasmides bactériens, ou des copies d’ADN linéaires de gènes, dans des noyaux de mammifères conduit à l’insertion de l’ADN dans les chromosomes, éventuellement en multiples copies dans un agencement tandem tête-à-queue. ). Cette procédure est généralement considérée comme plus satisfaisante que l’utilisation d’un vecteur viral car elle évite la possibilité que l’ADN viral infecte les cellules et provoque des défauts quelconques. La micro-injection d’ADN est la base de la création d’un animal transgénique, qui contient un gène cloné dans toutes ses cellules. Une souris transgénique peut être générée par micro-injection d’un ovule fécondé qui est ensuite cultivé in vitro pour plusieurs divisions cellulaires et ensuite implanté dans une mère nourricière. En outre, une cellule embryonnaire peut aussi être utilisée. Celles-ci sont obtenus à partir d’un embryon précoce et, contrairement à la plupart des cellules de mammifères, sont totipotents, ce qui signifie que leur modèle de développement n’est pas prédéfini et les cellules descendantes peuvent former de nombreuses structures différentes chez la souris adulte. Après micro-injection, la cellule embryonnaire est replacée dans un embryon qui est implanté dans l’utérus de la mère. La souris résultante est une chimère, comprenant un mélange de cellules modifiées et non modifiées, car l’embryon qui reçoit la cellule manipulée contient également un certain nombre de cellules ordinaires qui contribuent, avec la cellule manipulée, à la composition de la Souris adulte. On obtient des souris non-chimères, qui contiennent le gène cloné dans toutes leurs cellules, en permettant à la chimère de se reproduire, car une partie de la progéniture sera dérivée d’ovules qui contiennent le gène cloné.